Veteriner Laboratuvar Teknikleri ve Prensipleri Dersi 1. Ünite Özet

Damıtık Su (Distile Su, Saf Su)

Su laboratuvarlarda kullanılan ideal bir çözücüdür ve uygun şekilde arındırılması gerekmektedir. Ca ²⁺ , Mg ²⁺ ,CO ₃ ^2- , NH ₄ ⁺ , Fe ₃ ⁺ sularda en yoğun rastlanan iyonlardır. Sabun ile kolayca köpürmeyen ve lezzeti hoş olmayan, Mg ve Ca tuzlarını ihtiva eden sular sert su olarak bilinir. Sert su-Yumufşak su: Suda çözünmüş halde bulunan Kalsiyum (Ca) ve Magnezyum (Mg) bileşiklerinin toplamı suyun sertliğini gösterir. Genelde Fransız sertliği (Fr) birimi kullanılır (1 Fr = 10 mg/L CaCO ₃ ). Buna göre > 30 Fr = çok sert; 20-30 Fr = sert; 10-20 Fr = orta sert; 5-10 Fr = yumuşak; 0-5 Fr = çok yumuşak su olarak tanımlanır. Laboratuvarda su denince daha çok saf su (damıtık su, distile su) akla gelir. Saf su, yapısında su molekülleri dışında katı madde ve mineralleri çözünmemiş sudur. Saf suyun elektrik iletkenliği zayıftır. Normal su (şebeke suyu, çeşme suyu) çözünmüş iyonik katılar içerdiği için elektriği iletir. Distile su “dH ₂ 0” olarak kısaltılır. Bir de “ddH ₂ 0” (çift distile su - double distilled water) vardır. O da genelde deiyonize suyun distile edilmesi ile elde edilir. Bidistile (veya Redistile ) su iki defa damıtılmış sudur. Çok hassas çözeltilerin hazırlanmasında kullanılır. İkinci damıtmadan önce suya bir miktar potasyum permanganat ilave edilerek damıtmadan sonra organik atıklarla uzaklaştırılması sağlanır. Şebeke suyunun iyonlarından arındırılması işlemine deiyonizasyon, iyonlarından arındırılmış suya da deiyonize su denir. Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi laboratuvarda kullanılmak üzere üç tip su tanımlamaktadır:

• Tip I Su: En az karışıklık ve en üst düzeyde dikkat ve doğruluk gerektiren test yöntemlerinde (iz element saptanması, enzim ölçümleri, yüksek verimli kromatografi, elektrolit tayinleri, tampon ve standart hazırlama vb.) kullanılır. Tip I su üretildikten hemen sonra kullanılmalıdır.
• Tip II Su: Kalitatif kimya yöntemleri için kullanılır, ayrıca hematoloji, immünoloji ve mikrobiyolojide yürütülen yöntemlerin çoğunda kullanılabilir. Steril şişelenmiş sudur.
• Tip III Su: Tip I ve II suyun üretilmesinde su kaynağı olarak, ayrıca cam eşyaların yıkanması ve çalkalanmasında kullanılabilir. Otoklavların beslenmesi ya da ısıtma banyolarının doldurulması gibi kritik olmayan uygulamalar için uygundur. Bu kalitede saf su genellikle ters ozmoz sistemiyle üretilir.

Damıtık Su Elde Etme Yolları

Nehirler, göller, kaynaklar ve kuyulardan sağlanan sularda çeşitli inorganik ve organik bulaşmalar olur. Bulaştırıcılar (kontaminant) tek bir saflaştırma yöntemi ile tam olarak uzaklaştırılamazlar. Ancak, çeşitli yöntemler ile damıtık su elde edilebilir:

1. Filtrasyon
2. Distilasyon
3. Deiyonizasyon
4. Ters ozmoz
5. Adsorbsiyon
6. Diğer yöntemler

Filtrasyon: Normal su çeşitli filtrelerden geçirilerek damıtık su elde edilebilir. Bu amaçla 3 tip filtre kullanılmaktadır: ön filtreler, ikinci tip filtreler ve üçüncü tip filtreler. Ayrıca üst düzey saf su sistemlerinde pirojenleri sudan ayırmak için ultrafiltrasyon kullanılmaktadır.

Distilasyon (Damıtma): İşlem sırasında su molekülleri sıvı - buhar ve tekrar sıvı olmak üzere faz değişikliklerine uğrar. Bu faz değişimi suda çözünmüş bazı kirlilikleri ve bileşenleri ayırır. Distilasyon su arıtma işlemleri içerisinde geniş yeteneklere sahip tek formdur. Distilasyona uğrayan su Tip 2 veya Tip 3 suyun özelliklerini taşır.

Deiyonizasyon: Deiyonizasyon, çözünmeyen reçine polimerleri içinden normal suyun geçirilmesi işlemidir. Reçine normal suda bulunan iyonlaşmış kirlilikleri H ⁺ ve OH ^- iyonları ile değiştirir. İyon değiştirme işlemi ile iyonları uzaklaştırılmış suya deiyonize su denir. Reçine polimerleri, katyon veya anyon değişikliği yapan asit veya amino grupları ile hazırlanır. Deiyonizasyon Tip I damıtık su için direnç üreten tek teknolojidir.

Ters Ozmoz: Sudaki istenmeyen maddelerin, özel bir zardan belirli bir basınç altında geçirilerek filtre edilmesi işlemidir.

Adsorbsiyon: Aktive edilmiş karbon, kil, silikon veya metal oksitlerinin adsorbsiyonu ile organik kirlilikler sudan uzaklaştırılabilir. Deiyonizasyon, adsorbsiyon ve filtrasyon birlikte uygulanarak Tip I su üretilebilir.

Diğer Yöntemler: Ultraviyole (UV) ışığı ile fotokimyasal oksidasyon (185 ve 254 nanometre dalga boyunda) iz organikleri ortadan kaldırabilir ve saf suda mikropları öldürebilir. 254 nanometre dalga boyunda ultraviyole ışık bakteri üremesini önlemede depolama rezervuarlarında veya dağıtım hatlarında kullanılabilir.

Suyun Saflık Testleri

Suyun saflığının belirlenmesinde, suyun spesifik rezistansının, spesifik kondüktansının ölçümünden yararlanılmaktadır. Kullanılan testler şu şekildedir:

• Su rezistans testi
• Saat camı ile damıtık suda saflık kontrolü
• Damıtık sularda klorür (Cl) kontrolü
• Damıtık suda karbondioksit varlığının tespiti ve uzaklaştırılması

Ayıraç (Reaktif)

Kimyada ayıraç (reaktif), belirli bir bileşik ile karakteristik bir reaksiyona girebilen ve bu sayede o bileşiğin varlığını, hatta miktarını belirlemeye yarayan bir çözeltidir. Cisimleri birleşime veya ayrışıma uğratarak niteliklerini belirtmede kullanılan maddelerdir. Kalitatif ve kantitatif analizlerde sıkça kullanılan birçok ayıraç vardır, damıtık suda hazırlanmış çözeltiler halindedirler. Bazı örnekleri şu şekildedir:

• % 3 Asetik Asit Ayıracı (0.5 M çözelti)
• Barfoed Ayıracı
• Bial Ayıracı
• Biüret Ayıracı
• Diazo Ayıracı (Benzen diazonyum klorid)
• Esbach Ayıracı
• Fehling Ayıracı
• Fenolftalein
• Glikoz Çözeltisi (%5)
• Fouchet Ayıracı
• İndifferent Ayıracı (Doymuş NaCl-K ₂ SO ₄ Çözeltisi)
• Kunkel Fenol Ayıracı
• Metil Oranj
• Molisch Ayıracı
• Ninhidrin Ayıracı (%0.1)
• Rottera Ayıracı
• Seliwanof Ayıracı
• Sodyum Nitroprussid Ayıracı
• Sülfomolibdik Asit Ayıracı
• Tannik Asit Ayıracı (%10)
• Türk Eriyiği

Tampon Sistem

Vücutta gerçekleşen biyokimyasal olayların çoğunluğu kan ve diğer vücut sıvılarının pH değerlerinin dar bir sınır içinde (7.35 - 7.45) düzenlemesine bağlıdır. Bir sıvı veya çözeltinin pH değeri tampon sistemler kullanılarak göreceli bir şekilde sabit tutulabilir. Bu şekilde, çeşitli bileşiklerin katkısı ile büyük pH değişiklikleri engellenir. Az miktarda asit veya baz ilavesine karşılık H ⁺ derişimi sabit kalan sistemlere tampon sistemler denir. Tampon sistemler zayıf asit ve tuzu ya da zayıf baz ve tuzundan meydana gelen çözeltilerdir. Genellikle bazlarının adıyla anılır. Asetat tamponu, fosfat tamponu gibi.

Bir tampon sistem asit eklendiğinde bir baz, baz eklendiğinde bir asit gibi davranır. Az miktarda asit veya baz eklendiğinde pH değişikliklerine direnç gösteren tampon çözeltiler pH değişimlerine karşı organizmayı korur. Zayıf asit ile konjuge bazının eşit molar derişimde bulunması halinde (pH = pKa olduğunda) tamponlama kapasitesi en yüksek değere ulaşır. Laboratuvarda Yaygın Şekilde Kullanılan Tamponlar:

• Bikarbonat Tamponu Na ₂ CO ₃ /NaHCO ₃ ) pH = 9.2- 10.2
• Fosfat Tamponu (Na ₂ HPO ₄ , / KH ₂ PO ₄ ) pH = 5.29- 8.04
• Asetat Tamponu (CH ₃ COOH/CH ₃ COONa) pH = 3.8- 5.6
• Tris (Hidroksimetil) Aminometan Tampon (pH = 7.2- 9.0)

Kalibrasyon

Laboratuvarlarda kullanılan ölçme aletleri zamanla sıcaklık, basınç, nem vb. dış etkenler sebebiyle hatalı ölçümler yapmaya başlarlar. Bu nedenle, laboratuvarlarda kullanılan bu aletler zaman zaman kalibre edilmelidir. Belirli koşullar altında doğruluğu bilinen bir referans ölçüm standardı veya ölçüm sistemini kullanarak doğruluğu aranan diğer bir standart veya test/ölçü aleti ya da sistemin doğruluğunun ölçülmesi, sapmalarının belirlenmesi ve rapor edilmesi işlemine kalibrasyon denir. Cihaz kalibrasyonu , cihazın en doğru ölçümü yapabilmesi için belirli periyotlarda testlere tabi tutulması, ölçümlerin gözlenmesi, standartlarla karşılaştırılması ve hata paylarının en aza indirilmesidir. Kalibrasyon analiz materyalinin türüne göre çeşitlendirilebilir:

1. Teknik alet ve cihazların kalibrasyonu: Laboratuvarda kullanılan ölçüm cihazlarının zaman zaman kalibre edilmesi gerekir.
2. Cam malzemelerin kalibrasyonu: Laboratuvarda günlük olarak kullanılan cam malzemelerin de (pipet, mezür, balon vb) zaman zaman kalibre edilmeleri önemlidir.
3. Otomatik pipetlerin kalibrasyonu: değişik derecelerde kalibre edilmiş otomatik pipetler sık sık kontrolleri yapılarak laboratuvarın hatalı sonuç vermesi önlenmelidir.
4. Test kalibrasyonu: Testin laboratuvara adaptasyonu ve uygulama sırasında yaşanacak hataları önceden ortadan kaldırmak için test kalibrasyonu yapılır. Bu amaçla, test baştan sona laboratuvarda uygulanır ve laboratuvar koşullarına adapte edilir.

Validasyon, onay, geçerlilik demektir. Bir ölçüm işleminin, bir sistemin, bir cihazın, bir metodun, bir yazılımın; belirlenen koşullara ve amaçlara uygunluğunun objektif olarak test edilerek yazılı delillerle onaylanması için yapılan işlemlerdir.

Kontrol Serumları

Yanlış çalışan aygıtlar, son kullanım süresi dolmuş kitler, dikkatsiz laboratuvar çalışanlarının varlığı gibi nedenlere bağlı olarak test sonuçları günden güne uyumluluk göstermeyebilir. Bu farklılıkların ortadan kaldırılması için, kontrol serumları (örnekleri) kullanılır. Referans kontroller , test işlemlerinin doğrusallığını tesis etmek için, hasta değerlerinin beklenen aralık içerisinde en az üç düzeyde kullanılması tavsiye edilir. Bu işlem her test ile çalıştırılmalıdır. Ölçüm standardı (etalon) belirli bir büyüklük değeri ve ilgili ölçüm belirsizliği ile bir büyüklüğün referans olarak kullanılmak üzere tanımının gerçekleştirilmesidir. Referans ölçüm standardı (referans standart) , belirli bir kurum ya da mekanda bulunan belirli tür büyüklüklere ilişkin diğer ölçüm standartlarının kalibrasyonu için belirlenmiş ölçüm standardıdır. Çalışma ölçüm standardı (çalışma standardı) ölçüm cihazları veya ölçüm sistemlerinin kalibrasyonu ya da doğrulanmasında rutin olarak kullanılan ölçüm standardı çalışma standardı olarak tanımlanır.

Referans Değer ve Referans Değer Aralığı

İyi tanımlanmış kriterlere göre seçilmiş bireylere referans birey denir. Bir referans bireyinde belirli bir fenotipin gözlemlenmesi ya da ölçülmesi yolu ile elde edilen değere referans değer denir. Dolayısıyla örnek bir popülasyondan seçilen referans bireyleri bir araya getirilerek, bir referans kümesi ya da grubu oluşturulabilir. Referans değerler ve referans aralıklar laboratuvar test sonuçlarının yorumlanmasında temel alınır ve klinisyen hekimlere hastanın değerlendirilmesinde yardımcı olur.

Uluslararası Birim Sistemi (SI) ve Uluslararası Birimler

Ülkelerin farklı temel birimlerden oluşan farklı birim sistemlerini kullanmaları ve buna sıkı sıkıya bağlı kalmaları, yapılan bilimsel ve teknolojik araştırmaların sonuçlarının anlatımını ve tüm dünya uluslarınca anlaşılmasını zorlaştırmıştır. Bu durum uluslararası ortak bir birim sisteminin geliştirilmesi gerektiğini gündeme getirmiştir. Buna bağlı olarak Uluslararası Birim Sistemi (SI) oluşturulmuş ve tüm dünya ülkeleri tarafından yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır.

Uluslararası Birim Sistemi 7 temel büyüklüğe (uzunluk, kütle, zaman, elektrik akımı, termodinamik sıcaklık, madde miktarı ve ışık şiddeti) dayanan bir sistemdir. Bunlar 7 temel fiziksel büyüklüğü ifade eder. Diğerlerinin her birisi birbirinden bağımsız olarak tali birimleri oluşturur. SI birim sistemine dâhil edilen ve boyutsal değeri olmayan iki temel birim daha vardır. Bunlar, radyan (rad) ve steradyan (sr) olup ilki düzlemsel açı, ikincisi ise hacimsel açı ile ilgilidir.

Laboratuarda Sık Kullanılan SI Birimleri:

• Temel Birimler
  1. Uzunluk (metre)
  2. Kütle (kilogram)
  3. Zaman (saniye)
  4. Sıcaklık (Santigrad ya da Celcius)
  5. Işık Şiddeti (cd)
  6. Madde Miktarı (mol)
• Tali Birimler
  1. Hacim (litre)
  2. Derişim
     1. Ağırlık/Hacim olarak
     2. Molarite olarak
     3. Equivalan olarak
     4. Ozmol olarak (Ozmolarite)
     5. Molalite
     6. İyonik Güç
     7. Bir gazın derişimi

Laboratuarda Kullanılan Diğer Birimler:

• Basınç
• Frekans
• Radyoaktivite

Radyasyon Doz Birimleri:

• Röntgen
• Rad