Viroloji Dersi 6. Ünite Özet

Virolojik Teşhis Amacıyla Örnekleme

Virusların çevre şartlarına çok duyarlı olmaları teşhislerini sınırlamaktadır. Bu nedenle virolojik teşhis için örneklemeler doğru zamanda ve uygun şekilde yapılmalı, uygun materyaller alınmalı ve amaç doğrultusunda uygun laboratuvara gönderilmelidir.

Klinik semptomlar örneklemenin yapılacağı en doğru materyalin seçiminde en önemli belirleyici faktördür. Buna göre hastalık bulgularının yerleştiği doku ve sistemlere göre örnekleme yapılacak teşhis materyalleri seçilir (Tablo 6.1).

Kan örnekleri, mukozal örnekler, idrar ve dışkı örnekleri, organ ve biyopsi materyalleri kullanım amacına göre en uygun saklama materyalleri içerisine alınmalıdır.

Teşhis materyalleri ilgili birime gönderilirken materyalden kaynaklanabilecek çevresel kontaminasyonlar dikkate alınarak gerekli önlemler alınmalı ve materyal ile bilgi formu düzenlenmelidir.

Örneklerin Nakledilmesi: Teşhis için hazırlanan örnekleme materyalleri mutlaka hızlı bir şekilde ve soğuk zincir altında nakledilmelidir.

Örneklerin Testlerde Kullanılmak Üzere Hazırlanması

Teşhis materyalleri;

• Hücre kültürüne ekim için virüsü steril izotonik bir sıvı ortama almak
• Bakteri ve mantar kontaminasyonlarını elimine etmek,
• Hücre kültüründe oluşabilecek toksik etkileri en aza indirmek,

amacıyla bazı hazırlık aşamalarından geçirilmelidir. Hücre kültürüne ekilebilecek duruma getirilen teşhis materyali inokulum olarak adlandırılır.

Organ ve dışkı örnekleri, kan örnekleri ve svab (sürüntü) örneklerinin hazırlık aşamaları birbirinden farklıdır. Aynı şekilde bu örnekler, kullanım amacına göre farklı yöntemler kullanılarak çalışmaya uygun hale getirilmektedir.

Virolojik Teşhis Yöntemleri

Viral hastalıkların teşhisinde beş temel prensip izlenmektedir. Bunlar:

1. Virus partikülünün tespiti
2. Virus izolasyonu ve identifikasyonu
3. Viral antijenlerin tespiti
4. Viral nükleik asit tespiti
5. Virusa spesifik antikorların tespiti

Virus partikülünün tespiti , virus içeren materyallerin elektron mikroskopta inecelenmesi ile yapılır.

Virus izolasyonu ve identifikasyonu , zaman alıcı ve zahmetli olmasına karşılık viral hastalıkların kesin tanısında en güvenilir yol olarak gösterilmektedir. Örnekleme materyallerinden hazırlanan inokulumların hücre kültürüne ekilmesi ve virus üremesine bağlı olarak hücredeki değişimler takip edilerek tespit yapılır.

Virusun, bulunduğu bölgeden alınan örneklerle ekim yapılarak üretilmesine virus izolasyonu; üretilen yeni virus suşuna ise izolat adı verilmektedir.

Viral antijenlerin tespiti ile yapılacak teşhis çalışmaları, doku materyallerinde virus antijenlerinin gösterimi veya inokulumun ekildiği hücre kültürlerinde virus antijenlerinin gösterimi esasına dayanan iki farklı yöntemle yapılabilir. Konjugat adı verilen işaretli antikorlar bu yöntemlerin birçoğunda kullanılmaktadır.

Viral antijenlerin tespitinde kullanılan en yaygın yöntemler:

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) , duyarlılığı yüksek, hücre kültürü gerekli olmayan ve hızlı teşhis sağlayan bir yöntem olup en çok kullanılan yöntemdir. Substratta meydana gelen renk değişikliğinin yoğunluğu spektrofotometre ile ölçülerek değerlendirme yapılır. Analitik duyarlılığı oldukça yüksektir. ELISA için geliştirilmiş uygulama protokolleri indirekt ELISA, yarışmalı ELISA, sandviç ELISA ve immun-capture ELISA yöntemleri olarak gruplandırılmaktadır.

İmmunoperoksidaz tekniği , PLA tekniği olarak da bilinmektedir. Bu teknikte konjugat olarak peroksidaz enzimi ile işaretli antikorlar kullanılmaktadır. Düşük maliyetli olması ve sonuçların invert ışık mikroskobunda değerlendirilebilmesi gibi avantajları olmasına rağmen, hücre kültürünün gerekli olması, steril çalışma şartları gerektirmesi ve göz ile değerlendirilmesi gibi dezavantajlara sahiptir.

FAT olarak da adlandırılan İmmunofloresan tekniğinde konjugat, enzim yerine ışıldama oluşturan boyalar ile işaretlenmektedir. En çok kullanılan boyalar FITC ve rodamin’dir. Test sonuçları floresan mikroskop ile değerlendirilir. En önemli avantajı sonuçların çok kısa sürede alınabilmesidir.

Hemaglütinasyon testi (HA) basit, ekonomik ve saha şartlarında uygulanabilen bir yöntemdir. Hemaglütinasyon, virion yapısında hemaglütinin glikoproteini taşıyan virusların belirli canlı türlerine ait eritrositleri bağlayarak kümeleştirmesi ve çöktürmesidir.

Virusa spesifik antikorların tespitinde kullanılan serolojik yöntemler , özellikle epidemiyolojik çalışmalarda ve belirli bir bölgede yürütülen hastalık takip faaliyetlerinde kullanılan uygulamalardır.

Bu yöntemlerde uygulanan testin kontrolünü sağlamak ve sonuçları yorumlamak için pozitif ve negatif referans serumlar kullanılmaktadır. Pozitif ve negatif serum dışında bu çalışmalarda sıklıkla kullanılan bazı materyallere hiperimmun serum, tip spesifik serum, poliklonal serum ve monoklonal antikor örnek olarak verilebilir.

Nötralizasyon testi , virolojide en sık kullanılan serolojik yöntemlerdendir. Nötralizasyon, bir virusun enfeksiyon oluşturabilme yeteneğinin anatikorlar tarafından engellenmesi olarak tanımlanmaktadır. Bu testin başlıca kullanım alanları şunlardır:

• Aşılama öncesi ve sonrasında bağışıklık düzeylerinin belirlenmesi
• Epidemiyolojik çalışmalar
• Sürü bazında belirli hastalıkların kontrol, takip ve eradikasyonu
• Virus identifikasyonu
• Viruslar arasındaki serolojik yakınlıkların belirlenmesi

Nötralizasyon testi temelde enfektif virüs ve buna spesifik nötralizan antikorların birleşmesi temeline dayanmaktadır.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) , spesifite ve sensitivitesi yüksek olup sonuçları spektrofotometrede değerlendirilen kullanışlı bir yöntemdir. ELISA testinde en çok kullanılan metot indirekt ELISA yöntemidir.

Agar jel immunodifüzyon testi (AGID) , agar içerisinde hazırlanan farklı kuyucuklara konulan antikor ve antijenin jel içinde yayılıp karşılaşması ve birleşip çökelerek bir perisipitasyon hattı oluşturması esasına dayanan bir yöntemdir. Ucuz olması, kolay uygulanması ve cihaz gereksinimi olmaması en önemli avantajlarıdır. Ancak sonuçlar göz ile değerlendirildiğinden düşük duyarlılığa sahiptir.

Hemaglütinasyon inhibisyon , hemaglütinasyon yeteneğine sahip virusların bu özelliklerinin spesifik antikorlar tarafından engellenmesidir. Bu test virus veya antikor aranmasına veya kantitatif olarak hemaglütinasyonu inhibe eden antikor titresinin saptanmasına yönelik olarak farklı formatlarda düzenlenebilmektedir.

İndirekt immunofloresan tekniği (IFAT) ’nde hücreler bilinen virus ile enfekte edildikten sonra şüpheli serum örnekleri reaksiyona sokulur ve boyanmış hücrelerin görülmesi ile serumda aranan antikorların varlığı tespit edilmiş olur.

Viral nükleik asit tespitinde kullanılan yöntemler , viral etkenlerin şüpheli materyalde hızlı bir şekilde tespit edilmesine olanak sağlamakla birlikte yüksek duyarlılığa sahiptir. Hücre kültüründe üretimi zor olan bazı viruslar bu yöntem ile tanımlanabilmektedir. Virolojik teşhis çalışmalarında en çok kullanılan moleküler yöntemlerden bazıları şunlardır:

• Elektroforezis
• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
• Hibridizasyon