Temel Veteriner Histoloji ve Embriyoloji Dersi 1. Ünite Özet

Histoloji Tekniği

hücre ve hücrelerin oluşturduğu dokuların yapısal özelliklerinin mikroskop altında incelenebilir hale getirilmesini sağlayan preparat hazırlama yöntemlerine Histoloji Tekniği adı verilir. Histoloji tekniği uygulanan dokular genel olarak cansız incelenir, bazı dokuları ise vital boyalar aracılığı ile canlı olarak incelemek mümkündür. Hücre ve hücrelerarası maddeyi canlılığın sona erdiği andaki yapısal özellikleri ile korumak için yapılan işleme tespit (fikzasyon) denir. Tespit işlemi ile amacımız otolizi engellemektir. Histoloji laboratuarlarında kullanılan farklı tespit yöntemleri vardır. Tespit Yöntemleri:

Fiziksel tespit: Isıtma veya kurutma, frotilerin veya yayma kesitlerin etüv ya da mikrodalga fırında ısıtılarak kurutulması ile yapılır.

Kimyasal Tespit: İncelenecek doku örneklerine kimyasal madde ya da madde karışımlarını uygulayarak yapılan tespit yöntemidir. Tespitin uygulanış şekline göre ikiye ayrılır. Bunlar; perfüzyon tespiti ve daldırma (İmmersiyon) tespitidir.

Histoloji Tekniğinde Temel Aşamalar

• Materyalin (doku örnekleri) alınması
• Tespit (fikzasyon) ve yıkama
• Suyunu giderme (dehidrasyon)
• Parlatma veya saydamlaştırma
• Emdirme
• Gömme veya bloklama (blokaj)
• Kesme (kesit alma) ve lama yapıştırma
• Boyama ve kapatma

Tespit amacı ile kullanılan kimyasal maddeler

• Formaldehid (formol - H.CHO)
• Glasiyal asetik asit (CH3COOH)
• Etil alkol (C2H5OH)
• Civa klorür - Civa klorid (HgCl2)
• Pikrik asit (C6H2(NO2)3OH)
• Potasyum dikromat (K2Cr2O7)
• Osmiyum tetroksid (OsO4)
• Glutaraldehid
• Paraformaldehid

Tespit amacı ile kullanılan solusyonlar:

• Formol salin,
• Tamponlu nötr formalin,
• Formol alkol,
• Formalin sodyum asetat,
• Formalin amonyum bromide,
• Formol kalsiyum,
• Zenker,
• Helly,
• Bouın,
• Carnoy,
• Susa,
• Orth,
• Newcomer’s vb.

Kimyasal Tespit Aşamasında Üzerinde Durulması Gereken Faktörler

• Tespit solusyonunun amaca göre seçimi
• Tespit solusyonunun miktarı
• Tespit solusyonunun PH’sı
• Tespit süresi
• Doku parçasının büyüklüğü
• Ortam ısısı
• Tespit solusyonunun difüzyon gücü

Tespitten sonra su ya da dereceli alkoller ile yıkama yapılarak tespite ait kalıntıların uzaklaştırılması sağlanır.

Suyunu giderme: Aynı zamanda dehidrasyon da denir. Dokuların büyük bir bölümünü su oluşturduğu için %50’den başlayarak %100’e kadar dereceli etil alkoller ile dokunun suyu alınır. Etil alkolün dereceli olarak kullanılmasının nedeni dokular üzerindeki büzücü etkisinden dolayıdır.

Parlatma: Dokuları saydam (transparan) hale getirmek için yapılan işlemdir.

Emdirme: Suyu giderilmiş ve saydam duruma gelmiş doku parçalarına gömme materyali olarak kullanacağımız parafin veya paraplastın emdirilmesidir.

Gömme: Bloklama veya blokaj da denir. Dokunun gömme materyali içerisine yerleştirilmesidir. Gömme materyali olarak sert parafin ya da paraplast kullanılır.

Kesme (kesit alma) ve lama yapıştırma: Çevresinde gömme materyali ile birlikte bulunan dokudan çelik bıçaklar ya da disposable bıçaklar aracılığı ile 5-7µ kalınlığında kesitler alınır. Kesitler önce oda sıcaklığında distile suda yüzdürülerek kırışıklıklar açılır, daha sonra 40-45 °C’de %0,1 oranında jelatin içeren distile suda yüzdürülerek açılmayan diğer kırışıklıklarda açılarak kesitler lama çekilir. Lamlar yatay pozisyonda 37 °C’lik etüvde kurumaya bırakılır.

Boyama ve kapatma: Dokuları oluşturan hücreler canlıda renksizdir. Işık mikroskop altında inceleyebilemek için boyanması gereklidir. Rutin histolojik amaçlı kullanılan boyalar asidik ve bazik bileşikler gibi davranırlar, dokuların iyonize olabilen bölümleri ile bağlanırlar. Bazik boyalar ile bağlanan bölümleri bazofilik, asit boyalar ile bağlanan bölümleri asidofilik olarak tanımlanır. Histoloji laboratuarlarında yaygın olarak kullanılan bazı boya maddelerinin kimyasal yapıları ve bazı boya tekniklerinin amaçları kitabınızın 12. sayfasındaki tablo 1. 1 ve 1. 2’de özet olarak verilmiştir. Işık mikroskopide rutin histolojik boyama dışında histokimya, immunhistokimya gibi metotları kullanmak istediğimiz zaman tespit ve onu takiben kullandığımız süreçlerde (doku takibi) birtakım farklılıklar gerekir. Bunun nedeni tespit ve doku takibi sırasında dokulardaki bazı madde ve enzimlerin inaktive olmasıdır.

Preperasyon Hataları ve Artefaktlar

Tespit aşamasında tespitin yeterli olmaması ya da uzun süreli tespite bağlı olarak dokuda büzüşme, sertleşme buna bağlı olarak dokulardan kesit alınamaması, kesitlerin dağılması gibi durumlarla karşılaşılabilir. Dehidrasyon aşamasında aşırı dehidrasyon ya da yetersiz dehidrasyon nedeniyle hücreler içinde vakuoller oluşalabilir. Saydamlaştırmada doku örnekleri denature olabilir bu durumda kesitlerde farklı renklerde boyanmaya neden olur. Uzun süreli saydamlaştırma örneklerin aşırı sertleşmesine ve kesitlerin kırılmasına yol açar. Dokulara parafin emdirme sürecindeki yetersizlik kesitlerin lama alınması sırasında süratle dağılma ve kesitlerin lam üzerinde tam anlamıyla açılmaması ile sonuçlanabilir. Parafine gömülen doku örneklerinde çevrede yeterli parafin olması dokuya destek olarak kesitlerin daha düzgün olmasını sağlayacaktır. Kısaca özetlenen tüm bu preperasyon hataları kesitlerde artefaktlara neden olur. Artefakt, dokularda gerçekte var olmayan ancak histoloji tekniğinde kullanılan temel aşamalar ya da doku takibi sırasında oluşan ve boyanmış preperatlarda görülen istenmeyen oluşumlardır. Artefaktlar, kesit yüzeyinde boşluklar, dalgalanmalar, farklı tonlarda boyanmalar, boya kristallerinin çökmesi, hava kabarcıkları gibi birtakım görüntüler ile tanımlanabilir.

Elektron Mikroskobu Tekniği: Transmission elektron mikroskobu tekniği (TEM) ve scanning elektron mikroskobu tekniği (SEM)’de kullanılan metotlar farklılıklar gösterirler.

TEM Tekniği: Işık mikroskopide kullanılan temel basamaklar TEM’de de vardır, ancak daha yüksek büyütme gücü nedeni ile proteinlerin çapraz bağlarının daha spesifik olması gerekmektedir. Bu amaçla tespit için glutaraldehid, paraformaldehid, osmium tetraoksid, potasyum permanganat’ın tamponlu solusyonları kullanılır.

SEM Tekniği: Örneğin yüzeyini tarayarak üç boyutlu görüntü elde etmeyi sağlayan bir tekniktir. Bunun için örneklerin yüzeyi altın yada palladium gibi ağır metallerin ince bir katmanı ile kaplanır. Örneğin yüzeyini tarayan elektron demetlerinin bazılarının yüzeyden yansıması, bazılarının da fırlatılması söz konusudur. Bu elektronlar elektron dedektörleri tarafından tutularak bir monitörde üç boyutlu düzlemde değerlendirilir. Görüntülerin kalıcı olması için fotoğraflanabilir ya da bilgisayarda saklanabilir.

Dondurma - Kırma Tekniği: Bu teknik membranların iç yüzeylerinin makromoleküler yapısını ortaya koyar. Dondurma aşamasında buz kristallerinin oluşumunu önlemek için kriyoprotektanlar kullanılır. Dondurulmuş örnekler çok keskin bıçaklar ile iç ve dış yaprakların moleküler bağlantılarının olduğu bölgeler arasından kırılır. Kırılan yüzey buharlaşmış platin ve karbon ile kaplanır ve elde edilen kopya doku sindirildikten sonra TEM’de incelenir.

Histolojik Kesitlerin Işık Mikroskobunda Değerlendirilmesi

Doku veya organlardan alınmış parçalara doku takibi uygulanmasından sonra kesitler alınır, lamlara yapıştırılır, boyanır ve mikroskopta incelenmeye hazır hale gelir. Bu kesitler dokuları oluşturan hücresel, ipliksel ve tübüler yapılardan meydana gelir. Hücreler değişik şekil, büyüklük ve tabakalanmalar gösterir. İpliksel yapılar sıkıdır, bağ doku sinir doku gibi.

Yuvarlak Bir Cismin Kesit Görünümleri

Aslında kendisi de gerçek bir hücre olan tavuk yumurtaları yuvarlak bir cismin kesit görünümleri için mükemmel bir örnektir. Katı pişmiş bir yumurtada yumurta sarısının ortadaki çekirdeği, yumurta akının da çevresindeki sitoplazmayı simgelediğini düşünelim. Bu yapıları dıştan yumuşak yumurta zarı ve sert yumurta kabuğu çevreler, yumurtanın alt ucunda ise hava boşluğu bulunur. Kitabınızın 15. Sayfasındaki Şekil 1. 7’de yuvarlak yumurta hücresinin görünümü yer almaktadır.

Tübüler Bir Cismin Kesit Görünümleri

Histolojik kesitlerde sıklıkla gördüğümüz tübüler yapılar en kolay enine kesitlerde tanımlanırlar. Bir kan damarı, kanal veya bezin histolojik yapısını tek katlı epitel ile kaplanmış kıvrımlı bir tüpten enine uzunlamasına ve oblik alınmış kesitlerde gözlemlenebilir. Kitabınızın 15. Sayfasındaki Şekil 1. 8’de Tubuler bir cismin kesit yüzleri ve görünümleri yer almaktadır.

Histolojide Kullanılan Özel İnceleme Yöntemleri

Otoradyografi: Doku içinde yer alan radyoaktif materyali bir doku kesiti aracılığı ile üzerinde yer alan fotoğraf emülsiyonuna aktaran metottur. Bu yöntem ışık ve elektron mikroskopların her ikisinde de kullanılabilir.

Histootoradyografi: Bir histootoradiyografta, normal bir röntgende olduğu gibi kitle görüntülenir. Her ne kadar yumuşak dokuları incelemek için X ışınları kullanılabilmesine rağmen en büyük yararları kemik ya da diğer mineralize dokuların zemin bölümlerinin incelenmesidir.

Histokimya: Histolojik kesitlerde doku ve hücre içindeki organik ve inorganik maddelerin varlığını ve yerleşimini tespit ederek kimyasal yapıyı ortaya koymayı amaçlayan histoloji tekniğidir. Histokimyasal reaksiyonda, incelenen maddenin dokuda bulunduğu yerde kimyasal olaylar zinciri sonucunda renkli bir bileşiğin çöktürülmesi amaçlanır. Çökeltinin durum ve şiddeti maddenin miktarı hakkında bilgi verebileceği gibi, mikrospektrofotometrik yöntemlerle daha kesin sayısal veriler elde edilebilir. Bu yöntem ile protein ve aminoasitler, nukleik asit ve nukleoproteinler, karbonhidratlar, lipidler, lipoproteinler, enzim, pigment ve inorganik oluşumlar tespit edilebilir.

İmmunositokimya: İşaretlenmiş antikorlar ile hücre ve doku antijenlerinin gösterilmesini sağlayan tamamen antijen antikor spesifikliğine dayanan bir tekniktir. Bir canlıya antijen veya yabancı bir protein enjekte edildiğinde canlının savunma hücreleri tarafından antikorlar üretilir. Antikorlar antijen yada yabancı proteini spesifik olarak bağlayan proteinlerdir. Antikorlar laboratuarlarda saf olarak elde edilip fluoresan boyalar ile bağlanabilir ve bu ayıraç tespit edilmiş ya da dondurulmuş kesitlere uygulanarak, fluoresan mikroskopta incelenip fotoğraflanabilir.

Hücre ve Doku Kültürü: Hücre ve dokuların organizma dışında(in vitro) yaşatılması ve çoğaltılmasını amaçlayan bir metottur. Hücre ve doku kültürü teknikleri, hücre davranışının analizine izin veren bir tekniktir. Doku ve organ parçalarının genel özelliklerini ve normal fonksiyonlarını korumak, devam ettirebilmek için kimyasal olarak oluşturulmuş büyüme faktörleri, hormonlar ve serum bileşenlerinin ilave edildiği sentetik bir ortam hazırlanır.

Hücre ve doku kültürü tekniklerinin kullanım alanları:

• Moleküler biyolojinin güncel metotları ve yeni DNA dizilimlerinin tanımlanmasında,
• Normal ve kanserli hücrelerin metabolizmalarının incelenmesinde,
• İnsan ve hayvanların patogen virüslerinin epidemiyoloji, teşhis, tedavi ve mücadeleleri üzerindeki çalışmalarda,
• Viral araştırmalarda, doğal konakçılar dışında üretilemeyen virüslerin üretilmesinde,
• Sitogenetik araştırmalarda, mitoz bölünme sırasında kromozomların sayı ve şekillerindeki anomalilerin saptanmasında.