Viroloji Dersi 3. Ünite Özet

Virüs Üretilmesinde Kullanılan Ortamlar

Deney Hayvanları: Deney hayvanları bakım ve besleme giderleri nedeniyle hücre kültürleri ve embriyolu yumurtalara göre daha maliyetlidir. Kullanımları ile ilgili oarak da birçok etik sınırlama mevcuttur. Ancak hiperimmun serum ve komplement gibi biyolojik materyallerin elde edilmesi amacıyla zorunlu olarak kullanılırlar. Fare, rat, tavşan, maymun gibi hayvalar sıklıkla kullanılırken bilimsel araştırma amacıyla kedi, köpek, koyun, sığır gibi hayvanların da denek olarak kullanıldığı görülmektedir. Hiper immunserum bir antijenin duyarlı bir konakçıya belli bir program kapsamında verilmesiyle elde edilen ve bu etkene karşı yüksek miktarda antikor taşıyan serumdur. Komplemen ise serumda bulunan ve antikorlar aracılığıyla gerçekleşen immunolojik reaksiyonlarda görev alan bir grup proteindir. Mikrobiyolojik özelliklerine göre deney hayvanları 3’e ayrılmaktadır.

1. Konvansiyonel Hayvanlar
2. SPF (Spesifik Patojen Free) Hayvanlar
3. Germ Free Hayvanlar

Konvansiyonel Hayvanlar: herhangi bir mikrobiyolojik müdahale yapılmayan, standart yetiştirme koşulları uygulanan hayvanlardır. Bünyelerinde hastalık olabilir veya olmayabilir. Bu yüzden kullanımlarında bazı kısıtlılıklar vardır. Ancak belirli biyolojik ürünlerin (komplement, amboseptör, negatif veya pozitif serum ) elde edilmesinde rahatlıkla kullanılabilirler. Amboseptör kotun eritrositlerine karşı tavşanlarda elde edilen antikorlardır. Amboseptör komplement fikzasyon testinde kullanır. Negatif serum bir hastalık etkenine karşı antikor taşımadığı bilinen serumdur iken Pozitif serum da bir hastalık etkenine karşı antikor taşıdığı bilinen serumdur.

SPF (Spesifik Patojen Free) Hayvanlar: Bünyelerinde hastalık etkeni (patojen) maddeler taşımazlar. Sürekli kontrol ve bakım altında tutulurlar. Su ve yemleri kontrolden geçirilir, yaşam ortamlarına filtre edilmiş hava verilir. Yapılan bilimsel çalışmalar konvansiyonel hayvanlar kullanılan çalışmalara göre daha güvenilir sonuçlar verir.

Germ Free Hayvanlar: Bünyelerinde hiçbir mikroorganizma bulundurmayan çok özel hayvanlardır. Özel şartlar altında annelerinden sezeryanla alınır. Su ve yemleri kontrol edilir, yaşam ortamlarına filtre edilmiş hava verilir. Dışkı ve kan örnekleri düzenli aralıklarla kontrol edilir. Yetiştirilmesi ve bakımı oldukça zor ve zahmetlidir. Bu hayvanlardan elde edilen veriler çok değerli ve güvenilirdir.

Deney hayvanlarına virüs inokulasyonunda yapılan çalışmanın amacına ve kullanılan virüs türüne göre seçilebilecek değişik ekim yollar vardır. Bunlardan en çok başvurulanlar arasında

• intranasal (burun boşluğuna),
• intratrakeal (trake içine),
• korneal,
• konjuktival,
• oral (ağız yoluyla),
• subkutan (deri alt›na),
• intradermal (deri içi),
• intravenöz (damar içi),
• intraperitoneal (periton içi) ve
• intramuskuler(kas içi)

yolla yapılan inokulasyonlar sayılabilir. (Sayfa 38 resim 3.1’ i inceleyiniz.)

Embriyolu Yumurtalar

Değişik hayvanların yumurtalı kullanılabilse de virüs üretilmesi amacıyla en çok kullanılan embriyolu tavuk yumurtası (ETY)’dir. Özellikle kanatlı virüsü, bazı memeli virüslerinin üretimi ve aşı üretiminde yoğun bir şekilde kullanılır. ETY’lere ekim için sıklıkla kullanılan 4 bölgeyi ve ETY’lerin genel yapısını öğrenmek için sayfa 39 Şekil 3.1 ve Resim 3.2’yi inceleyiniz. ETY’de en yaygın olarak üretilen virüsler çiçek virüsleri, influenza virüsleri ve kanatlı virüsleridir.

Embriyolu Tavuk Yumurtasına Virüs Ekimi: virüs ekimi yumurtanın farklı bölgelerinden yapılabilmektedir. Tüm noktalarda temel prensip aynı olmakla birlikte ekilen virüsün türüne bağlı olarak farklı uygulamalar da yapılabilmektedir. Newcastle hastalığı virüsünün üretilmesinde için 9-11 günlük yumurtalar kullanılarak koryo-allantoik boşluğa hava kesesi tarafından virüs ekiminin tüm aşamaları sayfa 40’da görülmektedir.

Hücre Kültürleri

Organ veya doku parçalarının canlılıklarını sürdürmek üzere vücut dışında belli bir süre muhafaza edilmeleri veya üretilmeleri organ kültürü olarak tanımlanır. Bu kültürler üç boyutlu yapılarını ve organizma içindeki şartlarda sahip oldukları histolojik özelliklerin birçoğunu muhafaza ederler. Hücre kültürü ise organizmadan alınan dokulardaki hücrelerin bireysel olarak ayrılması ve in vitro şartlarda kültüre edilmeleriyle elde edilir. Ayrıştırma mekanik veya enzimatik yolla gerçekleştirilir. Bu amaçla tripsin veya kollegenaz gibi proteolitik enzimler kullanılır. Vücuttaki birçok dokudan hücre kültürü hazırlanabilmesine rağmen, özellikle üreme yeteneği yüksek olan testis, böbrek, deri, diş eti ve kanserli dokulardan hücre kültürü hazırlamak ve bu kültürler ile çalışmak laboratuvar uygulamalarında kolaylık sağlamaktadır.

Direk olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelere primer hücre kültürü denir. Hücre kültürlerinin yeni flakslara (plastik türevi maddelerden üretilmiş kültür şişeleri) alınarak çoğaltılmasına subkültür hazırlama (veya pasaj) elde edilen kültüre de subkültür denir. Primer hücre kültürleri belli bir pasajlamadan sonra özelliklerini yitirirler. Primerlerle en az %85 oranında benzerlik gösteren bu yeni kültürlere diploid hücre kültürü denir. 20 pasaj seviyesinden sonra bunlarında üreme yetenekleri azalır ve morfolojik değişiklikler başlar. 70 pasajdan sonra elde edilen ve genetik olarak köken aldığı dokudan tamamen farklılaşmış kültürlere ise devamlı hücre kültürü denmektedir.

Hücrelerin in vitro şartlarda üretilebilmesi için “ hücre üretme vasatı ” adı verilen sıvı ortamlar kullanılır. Hücre üretme vasatı, hücre çoğalması için gerekli olan amino asitler, vitaminler, mineraller, iz elementler, glukoz vb maddeleri içeren, steril ve pH’ı dengelenmiş bir izotonik çözelti dir. Hücre üretme vasatlarına gelişmeyi teşvik edici faktör olarak %10 oranında serum ilave edilir. Ayrıca bakteri kontaminasyonuna karşı çeşitli antibakteriyellerde ilave edilir.

Hücre kültürleri üretildikleri ortamlara göre stationer kültürler ve süspanse kültürler olmak üzere ikiye ayrılır.

1. Stationer Kültürler: Bu tip hücre kültürlerinde hücreler kültür kabı yüzeyine tutunarak çoğalırlar. İnkübatör raflarında (sabit kültür) veya özel bir düzenekle dönen bir sistem içerisinde (roller kültür = dönen kültür) inkübe edilebilirler. Roller kültürler şişelerde veya tüplerde hazırlanabilir. Stationer kültürlerde hücreler çoğunlukla kültür kabı yüzeyini tek tabaka halinde kaplamaktadır. Buna monolayer hücre kültürü denir. Hücrelerin monolayer tabakalanması özellikle virüslerin üretilmesi sarasında oluşacak sitopatolojik değişiklikleri (CPE) takip edebilmek açısından önemlidir.
2. Süspanse Kültürler: Bu tip kültürlerde hücreler kültür kabına tutunmadan hücre üretme vasatı içerisinde süspanse haldeyken çoğalmaktadır.

Subkültür Hazırlanması: Monolayer hücre kültürleri kabın zeminini kapladıklarında pasajlanmaları gerekir. Bu hem yaşlanan hücrelerin dejenerasyonunu ve ölümünü engelleyerek hücre kültürünün devamını sağlar hem de daha fazla miktarda hücre ile çalışma imkânı verir. Hücrelerin kap yüzeyinden ayrılması için tripsin enzimi kullanılır. Pronaz, dispaz ve kollegenaz enzimleri de kullanılabilir ve kullanılacak enzim hücre tipine göre seçilir. Bu bölümle ilgili olarak şu kavramlar bilinmelidir. Dejenerasyon ; hücrenin normal morfolojik ve fizyolojik bütünlüğünü kaybetmesidir. Tripsin; pankreastan salgılanan ve bağırsaklarda protein sindirimine aracılık eden bir enzimdir. Hücre kültürlerinde kullanılan tripsin enzimi domuz pankreasından elde edilmiştir. Genellikle toz halinde temin edilen bu madde fosfat tampon çözeltisi içerisinde hazırlanarak 0,2µm por büyüklüğüne sahip filtreden geçirilerek steril edilir ve hücre kültürlerinde kullanılır. Süpernatant ; Süspansiyon halindeki bir sıvı santrifüj edildiğinde içerdiği katı faz (partiküller) çöker. Üstte kalan sıvı kısma süpernatant adı verilir. Subkültür hazırlama işleminin detaylı basamakları sayfa 42-43’de gösterilmektedir.

Hücrelerin Dondurulması ve Çözülmesi: Hem primer hem de devamlı hücrelerin bir kısmı dondurularak saklanır ve ihtiyaç halinde çözülüp yeniden kullanılabilir. Hücrelerin canlılıklarını koruyabilmesi için gereken sıcaklık en az -70 C ⁰ gereklidir ve hücreler böylelikle 1 yıldan daha fazla canlılıklarını koruyabilmektedirler. Daha uzun süreler için sıvı azot (-196 °C) gereklidir. Hücrelere zarar vermemek için dimetil sülfoksit (DMSO) veya gliserin gibi koruyucu maddeler kullanılır. Hücrelerin dondurulması ve çözülmesi için uygulanması gereken basamaklar sayfa 43- 44’de belirtilmiştir.

Hücre Kültürlerine Virüs Ekimi

Virüs ekimi için hücre kültürlerinin yeni hazırlanmış olması (1-2 günlük) ve kültür kabı zeminini en az %80 oranında kaplamış olması tercih edilir. Laboratuvar çalışmalarında Adsorbsiyonlu yöntem ve Adsorbsiyonsuz yöntem olmak üzere sıklıkla kullanılan 2 tip virüs ekim yöntemi vardır. En çok tercih edilen yöntem olan adsorbsiyonlu virüs ekim yöntemin temel basamakları sayfa 44 şekil 3.4'te açıklanmıştır. Burada inokolum kavramının bilinmesi gerekmektedir. İnokulum; teşhis materyallerinin değişik yöntemlerle işlenmesiyle elde edilen ve hücre kültürüne ekim için hazırlanmış materyallerdir.

Virüs Üremesinin Saptanması

Virüs üremesine bağlı olarak duyarlı hücre kültürlerinde meydana gelen morfolojik değişimler sitopatolojik etki (CPE) olarak adlandırılır. Yeni nesil olgun virüs partikülü oluşumu ile sonuçlanan (prodüktif = üretken) enfeksiyonların tamamı hücre kültüründe CPE oluşumuna neden olmayabilir. Virüsler, hücre kültüründe üremeleri sonucunda meydana getirdikleri değişikliklere göre Sitopatojen virüsler, Proliferatif virüsler ve Sitopatojen olmayan virüsler olmak üzere üç grupta toplanır.

Sitopatojen Virüslerin Üremesine Bağlı Hücresel Değişiklikler: Hücrelerde oluşan değişikliklerin başlıca nedenleri viral proteinlerin hücresel protein sentezini sekteye uğratması, virüs çoğalmasına bağlı toksik etki ve hücre zarına yerleşen viral proteinlerin membran yapısını bozarak ozmotik basıncı olumsuz yönde etkilemesi olarak sıralanabilir. Bu nedenlere bağlı olarak gelişen değişimler sayfa 45 Tablo 3.1 de verilmiştir.

Proliferatif Virüslerin Üremesine Bağlı Değişiklikler: Monolayer hücrelerin virüs üremesine bağlı olarak tabakalanıp yığın halinde çoğalması proliferative etki olarak adlandırılır. Hücre kültüründeki proliferasyon çoğunlukla lokaldir. Zaman zaman hücre kültürünün tamamına yayılmış bir proliferasyon da gözlenebilir. Proliferasyon daha çok tümör oluşturan virüslerin üremesine bağlı olarak şekillenir.

Sitopatojen Olmayan (Hücre Kültüründe Morfolojik Değişim Yapmadan Çoğalan) Virüsler: Bazı virüs türlerinde hücre kültüründe üremesi sırasında morfolojik değişimler gözlenmez. Bu tür virüslerin üreme ve üreme miktarlarının belirlenebilmesi için bazı özel testlere ihtiyaç vardır. Bu amaçla en sık kullanılan teknikler Hemadsorbsiyon testi, immunoperoksidaz testi, immnunofloresan testi, interferens ve Elektron mikroskobik incelemelerdir. Hücre üremesinin tespit edilmesi konusuna bağlı olarak Sinsityum, İnklüzyon cisimciği, Hiperkromazi, Hemadsorbsiyon kavramları sayfa 45 de açıklanmıştır.

Virüslerin Titrasyonu

Bir virüsün enfeksiyözite gücünün rakamsal olarak ifadesi o virüsün titresidir. Bu gücün belirlenmesi işlemine de virüs titrasyonu adı verilir. Virüsün titresi süspansiyonunda bulunan enfektif partikül sayısıyla ilgili bilgi verir. Titrasyon amacıyla sulandırmalar hazırlanır ve her sulandırma basamağında belli sayıda konakçı (hücre kültürü, EYT, denek hayvanı) sisteme ekilir. Test sonucunda konakçı sistemlerin en az yarısının enfekte olmuş olması beklenir. Titrasyon işleminde genellikle hücre kültürleri kullanılmaktadır ve elde edilen titre birimi Doku Kültürü İnfektif Doz (DKID ₅₀ ) olarak ifade edilir. Titrasyonun başlıca amaçları:

• Virolojik ve serolojik çalışmalarda soyların standardizasyonu
• Aşı hazırlanmasında virus dozunun ayarlanması
• Virüslerin belirlenmesinde kullanılan fizikokimyasal testlerin değerlendirilemsi
• Virüs soylarının saflaştırılması (Plak Test)

Plak Test: Birçok virüs türü hücre kültürlerinde çoğalma sırasında enfekte veya dejenere hücrelerden oluşan üreme odakları şekillendirir. Sınırları belirli olan ve çoğunlukla hücre erimesi, dejenerasyonu veya proliferasyonu ile karakterize olan bu üreme alanları plak olarak tanımlanır. Monolayer hücre kültürlerinde her plak bir enfektif virüs partikülü tarafından oluşturulur. Vasat içerisinde yarı katı bir ortam kullanılarak enfektif partiküllerin sayısını belirlemek mümkündür. Yapılan çeşitli işlem ve sulandırmalardan sonra virüs çoğalma odakları (plak) şekillenir. Testin değerlendirilebilmesi için sağlıklı hücreler kırmızı renge boyanır ve boyanmamış alanlar plak oluşturma ünitesi (POÜ) değerini belirler. Pratik olarak her bir alanın bir virüsü temsil ettiği varsayılır ve toplam virüs partikülü sayısı belirlenmiş olur. Tüm virüsler plak oluşturmazlar. Dolayısıyla sadece plak oluşturan virüsler için uygun bir testtir. Ayrıca karışık olan virüs izolatlarının veya aynı virüse ait değişik biyotiplerin saflaştırılması amacıyla da kullanılır.