Veteriner Laboratuvar Teknikleri ve Prensipleri Dersi 6. Ünite Sorularla Öğrenelim

Elektroforez nedir, tanımlayınız?

Çeşitlilik arz eden ve iyonize olabilen analitlerin ayırımına yönelik çok yönlü ve güçlü analitik tekniğe elektroforez denir.

İyonoforez nedir?

İyonoforez, elektroforeze benzer bir terim olup, sadece küçük iyonların göç etmesidir.

Zon elektroforez tekniğini açıklayınız.

Bu teknikte, tamponla karışım halinde olan örnekler agaroz jel katman gibi gözenekli bir ortama uygulandıktan sonra yük taşıyan moleküller farklı alanlar şeklinde hareket eder. Elektroforegram denilen ve destek materyali üzerinde komşularından kesin sınır ile ayrılan protein bölgeleri meydana getirir. Destek materyali proteine özgü boyalar ile işlem gördüğünde protein bölgeleri görünür hale gelir. Destek ortamı kurutulduktan sonra alanlarda yer alan proteinlerin miktarı dansitometre ile belirlenebilir. Elde edilen sonuçlar destek ortamının tamamen kurutulmasıyla kalıcı olarak saklanabilir.

Elektroforez prensibi nedir?

İyonize olarak yüklenen kimyasal moleküller; taşıdıkları yüke göre elektroforez sisteminde ya anoda ya da katoda göç ederler. Artı iyonlar katoda, negatif iyonlar ise anoda göç ederler. Artı ya da eksi yük taşıyabilen moleküllere amfolit denir ve kendi izoelektrik noktalarından daha asidik ortamda bulunanlar artı yük alarak katoda göç ederler. Daha alkali ortamda ise eksi yüklenerek anoda göç ederler.

Proteinler çözeltilerde neden amfolit gibi davranır?

Proteinler iyonize olabilen amino (NH2) ve karboksil (COOH) gibi grupları fazla sayıda taşıdıklarından çözeltilerde amfolit gibi davranırlar.

Göç etme hızının etkilendiği faktörler nelerdir?

Göç etme hızının etkilendiği faktörler: - Molekülün net yükü - Molekülün büyüklüğü - Molekülün şekli ? Elektriksel alan şiddeti - Destek materyalinin özelliği ? Çalışma ısısı

Elektroforetik hareket’i tanımlayınız.

Elektroforetik hareket, her bir birim alan şiddeti başına göç hızıdır. µ ile gösterilir.

Elektroforez cihazını açıklayınız.

Elektroforez işleminde kullanılan tamponu içeren alanda platin veya karbondan imal edilmiş elektrot bulunur. Pozitif veya negatif kutbun yükü, güç kaynağına bağlanma şekline göre belirlenir. Ayırımın gerçekleştiği ortam olan elektroforez desteği ya tampon ile doğrudan ya da fitiller ile dolaylı olarak temas eder. Cihaz, güç kaynağına doğrudan bağlı olduğu için personel ve sistemin korunması ve yüzeyden buharlaşmanın en aza indirilmesi amacıyla, uygun kapaklar kullanılarak kapatılır.

Güç kaynağının görevi nedir?

Elektroforetik işlemde güç kaynağının görevi elektriksel gücü sağlamaktır.

Elektroforez esnasında oluşan ısı formülünü ve değişkenlerin anlamlarını yazınız.

Isı E.I.t Formülde: E EMF- Elektromotif güç (Volt) I Akım (Amper) t Zaman (Saniye)

Proteinlerin göç hızındaki artışın ve destek ortamından suyun buharlaşmasının sebebi nedir?

Güç kaynağı sabit voltaj sağladığında, çözünmüş iyonların ısıyla uyarılması neticesinde akımda meydana gelen artış proteinlerin göç hızında artışa ve destek ortamından suyun buharlaşmasına neden olur.

Elektroforotik işlemde tampon çözeltilerin görevleri nelerdir?

Tampon çözeltilerin görevleri: - Akımı iletmek, - Elektroforezin gerçekleştirildiği pH’ı oluşturmak, - Çözünen analitin yükünü belirlemek.

İyonik kuvvetin etkisi nedir?

Tamponun iyonik kuvveti, destek ortamın iletkenliği üzerine etkilidir. İyonik bulutun hacmi, göç etme hızını ve elektroforetik alanların keskinliğini etkiler. Tampon konsantrasyonunun artması iyonik bulutun boyutunu genişletir ve molekülün rahatça hareketi baskılanır. Yüksek iyonik kuvvetli tampon sistemler, daha keskin hatlı bantların oluşumuna neden olur. Fakat aynı zamanda artan akım nedeni ile daha yüksek Joule ısısı oluşur. Bu da ısıya duyarlı proteinlerin denaturasyonuyla sonuçlanabilir.

Fenomen endozmoz nedir?

İyonlar yüksek oranda hidratize olduğunda kendilerinin hareketi içinde yer aldıkları çözücününde hareket etmesine neden olur. Buna fenomen endozmoz denir.

Destek materyallerine göre elektroforez çeşitleri nelerdir?

Destek materyallerine göre elektroforez çeşitleri: - Kağıt elektroforezi - Nişasta jel elektroforez - Selüloz asetat elektroforez - Agaroz jel elektroforezi - Poliakrilamid jel elektroforezi

Kağıt elektroforezi açıklayınız.

Serum proteinlerini ayırmada destek ortamı olarak geçmişte yoğun olarak kullanılmıştır. Bunun nedeni; destek ortamı olarak kolay elde edilebilmesi ve gerilme direncinin yüksek olmasıdır. Günümüzde bu destek materyalinin yerini selüloz asetat veya agaroz jel almıştır. Kağıt elektroforezde ayırım süresi uzundur ve oldukça fazla artalan etkileşimi görülür.

Nişasta jel elektroforezi açıklayınız.

Elektroforezde kullanılan ilk destek materyallerinden biridir. Geçmişte molekülleri hem büyüklük, hem de yüzeylerinde oluşan yükler açısından ayırmakta kullanılmıştır. Nişasta jeli, tekrarlanabilir şekilde elde etmek zor olduğundan rutin analizlerde kullanımı fazla kabul görmemiştir.

Selüloz asetat elektroforezi açıklayınız.

Selüloz asetat membranlar kuru, opak, kırılgan katmanlar olup, selülozun asetik anhidrit ile muamelesinden oluşmuştur. Kullanmadan önce tamponla ıslatılması ve dansitometrik miktar tayininden önce berraklaştırılması gerektiğinden, kullanımı nadirdir.

Agaroz jel elektroforezi açıklayınız.

Agaroz jel elektroforezi özellikle serum proteinlerinin, hemoglobin alt gruplarının, laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin, lipoprotein fraksiyonlarının ve diğer maddelerin analizinde kullanılır. Agaroz jel, rutin analizlerde kullanılabilirlik ve çok yönlülük yönünden selüloz asetata eşdeğer kabul edilmektedir. Agaroz gözenek büyüklüğünün fazla oluşu ve proteinlerin buralardan sekteye uğramaksızın geçmesi ayırımı tamamen yükün kütleye oranına dayandırmaktadır.

Agaroz jelin avantajları nelerdir?

Agaroz jelin avantajları: - Proteinlere karşı affinitesi düşüktür. - Kuruduktan sonra doğal berrak gösterir. - İyonize olan gruplardan temel olarak yoksundur. - Hafif endozmotik karakter gösterir.

Poliakrilamid jel elektroforezi açıklayınız.

Poliakrilamid, akrilamidin ve çeşitli katalizörlerin ortamda bulunması durumunda ısı yardımıyla meydana getirilen polimer çeşididir. Poliakrilamid potansiyel olarak nörotoksik ve karsinojeniktir. Poliakrilamid jel ısıya dayanıklı, şeffaf, sağlam ve kimyasal yönden göreceli olarak inerttir. Jel yük taşımadığından endozmoza neden olmaz ve farklı gözenek büyüklüğüne sahip jeller hazırlanabilir.

Fenomen moleküler eleme nedir?

Poliakrilamid jelde proteinlerin hem yük kütle oranına hem de moleküler büyüklüğe göre ayrılmasına fenomen moleküler eleme denir.

Konvansiyel elektroforez aşamaları nelerdir?

Konvansiyel elektroforez aşamaları; - Ayırım - Tespit - Boyama - Miktar tayini Ayrıca, bunlara ilave elektroforeze dayanan farklı blotlama teknikleri geliştirilmiştir.

Konvansiyel elektroforezde ayırım nasıl yapılır?

Elektroforetik ayırımı gerçekleştirmek üzere, ya önceden ticari olarak hazırlanmış agaroz veya poliakrilamid jeller kullanılır ya da uygun ekipmanlar ile elektroforez öncesi laboratuvarda hazırlanır. Her ikisinde de jelde hava kabarcığı olmamasına ve sıvı içeriğinin fazla olmamasına dikkat edilmelidir. Daha sonra örnek, destek materyaline uygulanır ve destek materyali daha önceden doldurulmuş tampon hazneleri ile temas ettirilir. Elektroforez, sabit akım ya da voltajda belirli bir süre ile uygulanır.

Konvansiyel elektroforezde tespit nasıl yapılır?

Elektroforez tamamlandıktan sonra, destek ortamı elektroforezin yapıldığı bölmeden alınır ve tamponu uzaklaştırılarak, birbirinden ayrılan komponentlerin difüzyonunu önlemek amacıyla tespit çözeltisine aktarılır.

Konvansiyel elektroforezde boyama nasıl yapılır?

Tespit aşamasından sonra boyama ile bireysel protein alanlarının görüntülenmesi sağlanır. Fazla boya materyali yıkanarak uzaklaştırıldıktan sonra destek ortamı kurutulur.

Konvansiyel elektroforezde miktar tayini nasıl yapılır?

Boyamanın ardından oluşan gözle görünür protein alanlarını direk dansitometri ile yüzde olarak ya da mutlak değer olarak belirtmek mümkündür. Dansitometrede jel veya diğer destek ortamı, ölçüm yapan optik sistem tarafından taranır. Her pike ait absorbans, uygun araçlar ile kağıt çizelgeye aktarılır veya elektronik olarak gösterilir.

Kromatografi tekniği nedir?

Kromatografi, birbiri ile yakın benzerliği ve ilişkileri olan analitlerin, ayrımı ve miktarlarının belirlenmesine yönelik kullanılmaktadır. Çözünmüş haldeki maddelerin, hareketli faz ve sabit faz arasında farklılık gösteren dağılımlarına göre ayrılmasını kromatografik sistemler sağlar.

Düzlemsel kromatografi nedir?

Kromatografi formlardan biridir. Bu teknikte, sabit faz bir kağıt yaprağa (kağıt kromatografi) veya katı yüzeye tutturulur (ince tabaka kromatografi).

Kağıt kromatografi nedir?

Düzlemsel kromatografi çeşididir. Kağıt kromatografide sabit faz suyun veya polar bir çözücünün kağıdın liflerine tutturulması sonucu oluşturulur.

İnce tabaka kromatografi nedir?

Düzlemsel kromatografi çeşididir. Silika jel gibi partiküllerin ince tabaka halinde cam levha, plastik ya da alüminyum katmanlar üzerine düzgünce yayılarak kaplanması ile oluşturulur. İnce tabaka küçük çaplı partiküllerden şekillendiği durumlarda tekniğe yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi denir.

Kolon kromatografi nedir?

Kolon kromatografide, sabit faz saf silika veya polimer olabilir. Destek ortamına ya kaplanmakta ya da kimyasal şekilde bağlanmaktadır. Sabit faz tüp içine doldurulabilir veya tüp iç yüzeyine kaplanabilir. Hareketli fazın gaz ya da sıvı olmasına göre kolon kromatografi gaz veya sıvı kromatografi olarak adlandırılır.

Birleşmiş teknikler nedir?

Gaz veya sıvı kromatografi teknikleri kütle spektrometresi ile beraber kullanılırsa buna birleştirilmiş teknikler denir.

Kromatogram nedir?

Hareketli faz, sabit faz içerisinden geçer. Bu sırada analitin kolondaki sabit fazla etkileşimleri sonucu, molekül özelliklerine göre bir sıralanma oluşur. Analitik gaz kromatografi veya sıvı kromatografide, hareketli faz kolondan çıkar ve dedektörden geçerek; zamanın, mesafenin veya hacmin fonksiyonunda elektronik sinyal oluşturur. Elde edilen grafiğe kromatogram denir.

Tutulma zamanı nedir?

Tutulma zamanı veya hacmi, analitin enjekte edildiği andan başlayıp kolondan geçerek dedektörü terk etmesi için gereken süre veya hareketli faz miktarıdır.

Kromatografik pik nedir?

Kromatogram tarafından sağlanan veri, analitlerin tanımlanmasını ve miktarca belirlenmesini sağlar. Kolondan ayrılan çözünmüş maddeler grafikte pikler halinde görülür. Buna kromatografik pik denir.

İyon değişim kromatografiyi açıklayınız.

İyon değişim kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun zıt yüküne sahip hareketli faz arasında iyonların yer değişimi esasına dayanır. Şartlara bağlı olarak çözünmüş maddeler ya katyon ya da anyon olarak bulunurlar. Ayırım, taşınan yüklerin fark ve miktarına dayanır. Sabit faz olarak görev yapan silika parçacıkları veya reçinenin yüzeylerine, anyonik veya katyonik yükleri sağlayan fonksiyonel gruplar bağlanır. Elektrokimyasal nötrlüğü sağlamak için ters iyon, sabit yüklere çok yakın konumda bulunur ve hareketli fazda yer alan çözünmüş iyonlar ters iyonlar ile yer değiştirirler.

Katyon değişim partikülleri ne amaçla kullanılır?

Katyon değişim partikülleri, katyonik karakterdeki çözünen maddeleri ayırmak için kullanılır. Bunlar negatif yüklü fonksiyonel grupları barındırır.

Anyon değişim dolgu materyalleri ne amaçla kullanılır?

Anyon değişim dolgu materyalleri anyonik karakterdeki çözünmüş maddelerin ayırımında kullanılır.

Bölümleme (partisyon) kromatografiyi açıklayınız.

Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İşlemsel olarak sıvılardan bir tanesi sabit fazı oluşturur. Bu fazın oluşturulması için ince tabaka sıvı destek materyali üzerine veya kapiller kolonun iç yüzüne adsorbe edilir. Ayırım çözünen maddelerin sabit ve hareketli faz arasında göreceli çözünme yeteneğine bağlı olarak şekillenir.

Sıvı-sıvı kromatografi çeşitleri nelerdir?

Sıvı-sıvı kromatografinin çeşitleri: - Normal faz kromatografi - Ters faz kromatografi

Normal faz kromatografide sabit ve hareketli faz olarak ne kullanılır?

Sabit faz olarak polar sıvı kullanılır. Hareketli faz olarak apolar çözücü veya çözücü karışımı kullanılır.

Ters faz kromatografide sabit ve hareketli fazın durumu nedir?

Ters faz kromatografide sabit faz apolar, hareketli faz göreceli olarak polardır.

Ters faz kromatografi çeşitleri nelerdir?

İyonik maddelerin ayırımında kullanılan iki farklı çeşit ters faz kromatografi bulunur: - İyon baskılama kromatografisi - İyon çifti kromatografisi

İyon baskılama kromatografisini açıklayınız.

İyon baskılama kromatografisinde, iyonik karakterli zayıf asit veya baz olan mobil fazın pH’ı değiştirilerek nötralize edilir. İyonik grubun nötralize olmasıyla analit daha az polar hale gelir ve apolar sabit faz ile daha iyi etkileşir.

İyon çifti kromatografisini açıklayınız.

İyon çifti kromatografisinde ters iyon (analite zıt kutuplu iyon) mobil faza ilave edilir ve analit ile iyonik çift meydana getirerek nötralize eder. Daha sonra bu çiftler ters faz kromatografi ile birbirilerinden ayrılır.

Soğurma (adsorbsiyon) kromatografiyi açıklayınız.

Adsorpsiyon kromatografinin esasını, çözünmüş maddelerin katı yüzeyde soğrulma (adsorpsiyon) ve salınma olayları arasındaki fark oluşturur. Elektrostatik hidrojen bağları ve dağılımsal etkileşimler bu tip kromatografiyi kontrol altında tutan faktörlerdir. Bu çalışma şekli ile gaz kromatografi kullanılarak düşük molekül ağırlık ve oda ısında gaz formunda olan moleküller birbirinden ayrılabilmektedir.

Boyut dışlama (jel filtrasyon) kromatografinin diğer isimleri nelerdir?

Bu kromatografi, jel filtrasyon, moleküler eleme, sterik eleme ve jel nüfuz kromatografisi olarak bilinir.

Boyut dışlama (jel filtrasyon) kromatografiyi açıklayınız.

Jel filtrasyon, moleküllerin büyüklüklerine göre ayrımını sağlar. Molekülün şekli ve hidratize formda bulunması işlemin sonuçlarını etkilemektedir. Küçük moleküller gözeneklerde geçici olarak yakalanır. Gözeneklere giremeyecek kadar büyük olan moleküller ise tutulmadan mobil faz ile beraber kolonu terk eder. Orta boydaki moleküller gözeneklerin bir kısmında geçici süre ile tutulurlar ve kolonu büyüklerden sonra, fakat küçük moleküllerden önce terk ederler.

Boyut dışlama kromatografide sabit faz olarak kullanılan materyaller nelerdir?

Sabit faz olarak çapraz bağlı dekstran, poliakrilamid, agaroz, polystrene-divinilbenzen gözenekli cam veya bunların farklı kombinasyonları kullanılır.

Affinite kromatografiyi açıklayınız.

Affinite kromatografi, analit ve bağlayıcı molekülün birbiri ile eşsiz bir biçimde bağlanması yöntemin esasını oluşturur. Enzim-substrat, hormonreseptör veya antijen antikor etkileşimleri bu teknikte kullanılmaktadır. Affinite kromatografide hem etkileşim yönünden hem de saflaştırılması planlanan biyomolekülün biyolojik aktivitesi yönünden çalışma sırasında uygulanan pH’a çok dikkat edilmelidir.

İmmunoassay nedir?

İmmunokimyasal reaksiyonlar, immunoassay olarak bilinen hassas ve özgül testlerin esasını oluşturmaktadır. İmmunoassayda analiti (antijeni) tanımak üzere, antikorlar ayıraç olarak kullanılmaktadır.

Antikor’u tanımlayınız.

Organizmada antijenle uyarı sonrası plazma hücreleri tarafından üretilen ve yapısı sayesinde onlar ile özgün olarak reaksiyona girme kapasitesine sahip proteinlere antikor denir.

En sık kullanılan immunokimyasal reaktif nedir?

İmmünoglobinler, organizmadaki 5 ana protein sınıfıdır ve her grubun farklı kimyasal yapısı ve özel bir biyolojik rolü vardır. Immunglobulin G (IgG) en sık kullanılan immunokimyasal reaktiftir. Molekül ağırlığı 158000 Da olan bir glikoproteindir. İki dubleks zincirden oluşmaktadır. Her set ağır ve hafif zincirlerden oluşur ve zincir disulfid bağları ile bağlanır.

Poliklonal’ı tanımlayınız

Kompleks bir antijen; farklı plazma hücrelerinden köken alan farklı özgüllükte antikorlar meydana getirir. Bu tür antikorlar poliklonal denir.

Epitop tanımını yapınız.

Moleküler antijenin eşsiz biçimde tamamlayıcı antikor tarafından bağlandığı bölgeye epitop yani antijenik determinant denir.

Immunojeni açıklayınız.

Immunojen, protein veya genellikle protein yapısındaki taşıyıcıya bağlanmış bir maddedir. Yabancı konağa girdiğinde antikor oluşumunu uyarır.

Affinite nedir?

Affinite, antikor ve antijen arasındaki etkileşime neden olan güç şeklidir. Antikorun bağlandığı tek bölge ile buna karşılık gelen antijendeki epitopun aralarında meydana getirdiği etkileşim enerjisini gösteren termodinamik miktardır. Affinite, bağlanan maddenin (antijen) özelliğini verir.

Avidite nedir?

Avidite, antikor ve antijen arasındaki etkileşime neden olan diğer bir güç şeklidir. Antikora ait tüm bireysel bağlanma bölgelerinin toplamını içine alan genel bağlanma gücüdür. Avidite, bağlayanın (antikor) özelliğini verir

Poliklonal antikor nedir?

Poliklonal antikorlar immunizasyon sonucu farklı plasma hücreleri tarafından elde edilmiş heterojen antikor karışımıdır. Bunun aksine monoklonal antikorlar tek koloni veya plasma hücresi hattından elde edilen üründür.

Monoklonal antikor nedir?

Monoklonal antikorlar tek koloni veya plasma hücresi hattından elde edilen üründür. İmmunoassaylerde sıklıkla kullanılan reaktiflerdir. Monoklonal antikorlar, tek bir deneyde aynı anda iki farklı antikorun kullanılmasına imkan sağlar. Monoklonal antikorlar tek epitopa özgü olduklarından antijenik molekülleri çapraz bağlama yetenekleri yoktur. Bu nedenle çöktürme reaksiyonlarında kullanılamazlar.

Antijen-antikor bağlanmasındaki bağlanma kuvvetleri nelerdir?

Antijen-antikor bağlanması için birlikte hareket eden farklı kuvvetler bulunur. Bunlar: - Elektrostatik van der Waals-London dipol dipol etkileşimleri - Hidrofobik etkileşimler - İyonik kolombik bağlanma

Antijen ve antikorun birbirine bağlanırken fazlarda neler meydana gelir?

Antijen ve antikorun birbirine bağlanması üç fazda devam eden denge reaksiyonudur. Bunlar: - İlk fazda multivalan, antijen (Agn) ile bivalan antikor (Ab) arasında çok hızlı şekillenir. - İkinci fazda oluşan kompleksin büyümesi görülür. - Üçüncü fazda kompleks kritik boyuta ulaştıktan sonra çöker.

Polimerlerin istenen özellikleri nelerdir?

- Yüksek molekül ağırlığına sahip olması, - Doğrusallığının yüksek olması, - Suda çözünürlüğün çok iyi olması.

Kalitatif amaçlı kullanılan başlıca immunokimyasal yöntemler nelerdir?

Kalitatif amaçlı kullanılan başlıca immunokimyasal yöntemler: - Pasif jel difüzyon - İmmunelektroforez - Western blot

Pasif jel difüzyonunu açıklayınız.

Jel difüzyon testlerinde antijen antikor çökme reaksiyonları sıvı yerine jel ortamda şekillenir. Jelin farklı noktalarında kuyucuklar açılarak, bu noktalara antijen ve antikorlar ilave edilir. Ozmoz, jel boyunca ilerlerken açılan kuyucuk etrafında kendi seri sulandırmalarını halkalar halinde oluştururlar. Agar içeren ortamda şekillenen difüzyon sırasında antijen ve antikorun miktarca eşit olduğu noktada çökme halkaları şekillenir.

Oudin jel difüzyon tekniğini açıklayınız.

Tek difüzyon-tek boyut sistemi kullanılmaktadır. Reaksiyona giren maddelerden biri agaroz jele dahil edilir. Jel sıvı halde iken şeffaf bir deney tüpüne aktarılır ve donması sağlanır. Bu işlemden sonra antikor solüsyonu jelin üst kısmına uygulanır. Antikor, jelde difüzyona uğrar ve ilerlerken konsantrasyonu azalır. Antikor ve antijenin konsantrasyonunun eşit olduğu noktada çökme görülür. Bu teknikte jelin üst kısmı ve çökmenin olduğu nokta arasındaki mesafe alınarak ölçümler yapılabilir. Bilinmeyen örneğin değeri farklı düzeylerde hazırlanmış standartlar ile karşılaştırılarak niceliksel ölçümler yapılabilir.

Ouchterlony tekniğini açıklayınız.

Çift difüzyon-çift boyut sistemidir. Agaroz petride hazırlandıktan sonra petride kuyucuklar açılır. Açılan kuyucuklar ya antijen ya da antikor çözeltisi ile doldurulur. Antijen ve antikorlar molekül büyüklüklüklerine oranla her yöne dağılmaya başlarlar. Karşılaştıkları optimum noktada çökme meydana gelir. Çökme çizgilerinin dikkatli incelenmesi çözeltide bulunan bireysel komponentlerin identifikasyonunu ve bir antijenin diğerleri ile ilişkisini ortaya koyabilir. Çizgilerin yorumlanması çoklu antijenantikor ilişkilerini ortaya koyabileceği gibi, oluşan mesafelerden antijen ve antikorun göreceli konsantrasyonunu belirlenebilir. Bunun yanında antijenantikor arası oluşan reaksiyon özdeşlik, kısmi özdeşlik veya özdeş olmama hakkında bilgi sağlayabilir.

Radial immunodifüzyon tekniğini açıklayınız.

Tek difüzyon-çift boyut sistemidir. Reaksiyona giren maddelerden biri agaroza dahil edilir ve agarozun petri kabında donması sağlanır. Agarozda kuyucuklar açıldıktan sonra bu noktalara antijen uygulanır. Antijenin radial difüzyonu sonucu antijen ve antikor konsantrasyonunun eşitlendiği noktada çökme görülür. Dairenin çapı antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Örnekteki antijen miktarını belirlemek için, referans antijenin bir seri sulandırması yapılır ve bundan elde edilen zon çapları ile standart eğri elde edilir. Standart eğri için referans antijenin konsantrasyonlarına denk gelen çaplar yarı logaritmik kağıda aktarılır. Standart eğri örnek ile karşılaştırılarak örneğin miktarı elde edilmiş olur.

İmmunelektroforez nedir?

Proteinlerin elektroforez tekniği ile ayırımını takiben antikorlar ile reaksiyona girmesine dayanan biyokimyasal yöntemlere genel olarak immunelektroforez denir.

İmmunofiksasyon testi nedir?

Klinik uygulamalarda immunofiksasyon testi belirli antijene karşı antikorun varlığını göstermede kullanılmaktadır. Bu teknik aynı zamanda apolipoprotein E gibi spesifik proteinlerin tespitinde de kullanılmaktadır. Test, üç aşamada gerçekleştirilir.

İmmunofiksasyon testinin ilk aşamasını açıklayınız.

İlk aşamada uygun destek ortamında antijen karışımının elektroforezi gerçekleştirilir. Elektroforez tamamlandıktan sonra destek ortamı nitrosellüloz veya PVDF tabanlı membran ile temas haline getirilir.

İmmunofiksasyon testinin ikinci aşamasını açıklayınız

İkinci elektroforez işlemi ile proteinler destek ortamından alınarak membrana aktarılır. Bu özel filtreler proteinleri geri dönüşümsüz olarak bağlar. Daha sonra membran protein çözeltisi ile muamele edilerek serbest olan tüm bölgelerin proteinle kaplanması sağlanır. Bloklama adı verilen bu aşamanın önemi bir sonraki basamakta ilave edilecek olan antikorun özgül olmayan şekilde bağlanmasını engellemektir. İlgilenilen proteine özgü antikor çözeltisi veya hasta serumu ilave edildikten sonra belirli bir süre inkübasyona tabii tutulan membran yıkanır. Yıkama aşamasında bağlı olmayan antikorlar uzaklaştırılmış olur.

İmmunofiksasyon testinin üçüncü aşamasını açıklayınız.

İkinci aşamadan sonra ilk antikora karşı spesifiteye sahip işaretli antikor ilave edilir. İlave edilen ikinci antikor önceden oluşan antijen-antikor kompleksini göstermekte kullanılmaktadır. Kullanılan ikinci antikor enzim işaretli ise uygun substrat ilave edilerek antijenantikor kompleksi gösterilmiş olmaktadır.

Elisa tekniğini nedir?

Enzimle işaretli antijen ya da antikorun serbest antijen ya da antikor ile reaksiyona girmesi ve oluşan antijen antikor kompleksinin enzim aktivitesinin enzime spesifik substrat varlığında ortaya konması esasına dayanan ölçüm tekniğidir.

Elisa yöntemini açıklayınız.

Test, polistren mikrotitrasyon plakalarında gerçekleştirilir. Plakalarda yer alan kuyucukları kaplamada antijen veya antikor çözeltileri kullanılır. İncelenen örnekler bu kuyucuklarda inkübe edilerek antijen-antikor kompleksi şekillenmesi sağlanır. Yıkama işleminin ardından enzimle işaretli antijen veya antikor ilave edilir. İşaretlemede kullanılan enzime özgü substratın ilavesi sonucu reaksiyon şekillenmesiyle elde edilen renkli ürünlerin absorbansı ölçülerek aranılan antijen veya antikorun miktarı belirlenmiş olur.

Antijen-enzim konjugatını kullanan yarışmalı elisa tekniğini açıklayınız.

Bu teknik enzimle işaretli antijen ile standart ya da örnek antijeninin katı faza kaplı sınırlı sayıda antikora bağlanmak üzere yarışmaya girmesi esasına dayanır. Enzimle işaretli antijenin antikora bağlanması serbest antijen tarafından engellenir. Oluşan rengin şiddeti örnekte aranan antijen miktarı ile ters orantılıdır.

Antikor-enzim konjugatını kullanan yarışmalı elisa tekniğini açıklayınız.

Teknik enzimle işaretli antikor ile standart ya da örnek antikorunun katı faza kaplı sınırlı sayıdaki antijene bağlanmak üzere yarışmaya girmesi esasına dayanır. İşaretli antikorun antijene bağlanması standart ya da test antikoru tarafından yarışmalı olarak engellenir. Oluşan rengin şiddeti test antikorunun konsantrasyonu ile ters orantılıdır.

Çift antikor sandviç tekniğini açıklayınız.

Yarışmalı olmayan elisa tekniği çeşididir. Burada iki antikor kullanılır ve ikinci antikor enzimle işaretlenir. İlk antikor ile katı faz kaplanır. Örnek ilavesinden sonra antijen antikor kompleksi oluşması sağlanır ve ardından işaretli antikor ilave edilir. En son substrat ilave edilerek renk oluşumu gerçekleştirilir. Oluşan rengin şiddeti test antijeninin konsantrasyonu ile orantılıdır.

Modifiye çift antikor sandviç tekniğini açıklayınız.

Bu teknikte kullanılan ikinci antikor enzimle işaretli değildir. Buna karşı elde edilmiş üçüncü bir antikor kullanılmaktadır. Katı fazı kaplamada kullanılan antikor ile ikinci antikor farklı türden hayvanlardan elde edilmiş enzimle işaretli üçüncü antikorun katı fazdaki antikora bağlanması bu şekilde önlenmiş olur. Oluşan renkli ürünlerin şiddeti doğrudan test antijeninin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.

İndirekt tekniği açıklayınız.

Antikor düzeyinin belirlenmesine yönelik bir tekniktir. Teknikte katı faza kaplanmış antijen ve test edilecek antikora karşı elde edilmiş ikinci bir antikor kullanılır. Oluşan rengin şiddeti test antikorunun konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.

RIA yöntemi nedir?

Yöntem, bir izotopla işaretli antijenin, işaretlenmemiş antijenle yarışmaya girerek antikorla bağlanmasına dayanır. RIA ile bir maddenin ölçülebilmesi için o madde immunojenik, saflaştırılabilir ve radyoaktif izotopla işaretlenebilir olmalıdır. RIA için hem konsantrasyon hem de büyüklük yönünden en uygun analitler: Peptid ve steroid hormonlardır.

IRMA yönteminde işaretli antijen yerine ne kullanılır?

IRMA yönteminde, işaretli antijen yerine, saflaştırılmış ve işaretlenmiş antikor kullanılmaktadır.

Likit sintilasyon cihazı ne amaçla kullanılır?

Likit sintilasyon cihazı, beta ışınlarını yayan izotopları ölçmek için kullanılır.

Sintilasyon kokteyli nedir?

Likit sintilasyon örneği, uygun çözücü ile karışım halinde bulunan aktif madde ve sintilasyon kokteylinin içeriğinde bulunan sintilatörden meydana gelir. Okzalo türevleri, toluen ve naftalin gibi organik bileşikler örneğe ilave edilir. Bu çözeltiye sintilasyon kokteyli denir.

Gama sayaçlarını açıklayınız.

Gama ışınlarının görülebilir ışınlara dönüştürülmesi amacıyla talyum içeren NaI kristalleri kullanılır. Kristal tarafından soğurulan ? ışınları talyumla aktive edilmiş NaI tarafından fotonlara dönüştürülür. Bu fotonlar sezyum elementinden üretilmiş katottaki ışığa duyarlı yüzey tarafından alınır ve absorbe edilen ışık fotonlarının sayısıyla orantılı olarak akım üretilir.

Polimeraz zincir reaksiyonunu açıklayınız.

DNA molekülünün belirlenen bir bölümü çok fazla sayıda kopyalanır. Reaksiyon başlangıcında kalıp DNA molekülü çok düşük konsantrasyonda iken reaksiyonun ilerleyen aşamalarında dramatik olarak artar. Bir önceki siklusta ürün olarak meydana gelen DNA parçası bir sonraki aşamada kalıp görevi yapar. Reaksiyon esnasında kullanılan primer ve dNTP gibi moleküllerin derişimi fazla değişim göstermez iken DNA polimeraz sınırlayıcı faktör olur. Isı ve pH da çok önemli değişiklikler şekillendiğinden moleküler etkileşim açısından dramatik dalgalanmalar oluşabilmektedir.

Baz eşleşmesi kuralı nedir?

Baz eşleşmesi kuralına göre: - Adenin (A), her zaman Timin (T) ile - Guanin (G), Sitozin (C) ile eşleşir.

Primer nedir?

DNA polimeraz tarafından DNA sentezlenmesi için kullanılan yol göstericiye primer denir. Bu ortalama 20 bazdan oluşan sentetik DNA dizisidir.

Elektroforez nedir?

Elektroforez, çeşitlilik arz eden ve iyonize olabilen analitlerin ayırımına yönelik çok yönlü ve güçlü analitik tekniktir. Yük taşıyan çözünmüş maddeler veya parçacıkların sıvı ortamda elektriksel alanın etkisiyle göç etmesi elektroforez tekniğinin kapsamını oluşturur.

İyonoforez nedir?

İyonoforez, sadece küçük iyonların göç etmesini tarif eder.

Zon elektroforez genellikle hangi uygulamalarda yer alır? Kısaca açıklayınız.

Zon elektroforez kapsamında ise daha çok klinik uygulamalar yer almaktadır. Bu teknikte tamponla karışım halinde olan örnekler agaroz jel katman gibi gözenekli bir ortama uygulandıktan sonra yük taşıyan moleküller farklı alanlar şeklinde hareket eder.  Elektroforegram denilen ve destek materyali üzerinde komşularından kesin sınır ile ayrılan protein bölgeleri meydana getirir. Destek materyali proteine özgü boyalar ile muamele edildiğinde protein bölgeleri görünür hale gelir. Destek ortamı kurutulduktan sonra alanlarda yer alan proteinlerin miktarı dansitometre ile belirlenebilir. Elde edilen sonuçlar destek ortamının tamamen kurutulmasıyla kalıcı olarak saklanabilir.

Elektroforezin prensibi hakkında kısaca bilgi veriniz.

İyonize olarak yüklenen kimyasal moleküller; taşıdıkları yüke göre elektroforez sisteminde ya anoda (artı elektrod) ya da katoda (eksi elektrod) göç ederler. Artı iyonlar (katyon) katoda, negatif iyonlar ise (anyon) anoda göç ederler. Artı ya da eksi yük taşıyabilen moleküller amfolit olarak anılır ve kendi izoelektrik noktalarından (pI) daha asidik ortamda bulunanlar artı yük alarak (proton bağlayarak) katoda göç ederler. Daha alkali ortamda ise eksi yüklenerek (proton vererek) anoda göç ederler. Proteinler iyonize olabilen amino (NH₂) ve karboksil (COOH) gibi grupları fazla sayıda taşıdıklarından çözeltilerde amfolit gibi davranırlar.

Göç etme hızı nedir ve hangi etmenlerden etkilenir?

Göç etme hızı; molekülün net yükü, molekülün büyüklüğü ve şekli, elektriksel alan şiddeti, destek materyalinin özelliği ve çalışma ısısı gibi faktörlerden etkilenir. Elektroforetik hareket (µ) her bir birim alan şiddeti (volt/cm) başına göç hızı (cm/s) olarak tanımlanır.

Elektroforez cihazı hakkında kısaca bilgi veriniz.

İşlemde kullanılan tamponu içeren alanda platin veya karbondan imal edilmiş elektrot bulunur. Pozitif veya negatif kutbun yükü, güç kaynağına bağlanma şekline göre belirlenir. Ayırımın gerçekleştiği ortam olan elektroforez desteği ya tampon ile doğrudan ya da fitiller ile dolaylı olarak temas eder. Cihaz, güç kaynağına doğrudan bağlı olduğu için personel ve sistemin korunması ve yüzeyden buharlaşmanın en aza indirilmesi amacıyla, uygun kapaklar kullanılarak kapatılır.

Elektroforetik işlemde tampon çözeltilerin görevleri nedir?

Elektroforetik işlemde tampon çözeltilerin birden fazla görevi bulunmaktadır. Bunlar; akımı iletmek, elektroforezin gerçekleştirildiği pH yı oluşturmak, çözünen analitin yükünü belirlemek olarak sıralanabilir.

Endozmoz nedir? Kısaca açıklayınız.

Elektroforezde kullanılan destek ortamlarının bazıları suyla temas ettiğinde hidroksil iyonlarını adsorbe ederek negatif yüklenir. İyonlar yüzeye bağlanarak hareketsiz kalır. Çözeltide var olan pozitif iyonlar bu eksi yüklü sabit bölgeler etrafında kümelenerek bulut meydana getirirler. Bulutla ilişki halinde bulunan negatif iyon miktarı sabitlenmiş halde bulunan negatif iyonlardan uzaklaştıkça artar ve sonunda her iki iyon konsantrasyonu eşitlenerek dengeye ulaşır. Sisteme akım uygulandığında destek ortamına bağlı olan iyonlar sabit kalır fakat diğerleri kendilerinin aksi kutbuna serbestçe hareket etmeye başlarlar. İyonlar yüksek oranda hidratize olduğundan kendilerinin hareketi içinde yer aldıkları çözücününde hareket etmesine neden olur. Bu fenomen endozmoz olarak tanımlanır ve bu olay sonucunda su tek yönde hareket eder.

Destek materyallerine göre elektroforez tipleri nelerdir?

Kağıt Elektroforezi

Nişasta Jel ve Selüloz Asetat Elektroforez

Agaroz Jel Elektroforezi

Poliakrilamid Jel Elektroforezi

Kromatografi hakkında kısaca bilgi veriniz.

Kromatografi, birbiri ile yakın benzerliği ve ilişkileri olan analitlerin, ayrımı ve miktarlarının belirlenmesine yönelik kullanılmaktadır. Çözünmüş haldeki maddelerin, hareketli faz ve sabit faz arasında farklılık gösteren dağılımlarına göre ayrılmasını kromatografik sistemler sağlar. Bu işlem sırasında hareketli faz aracılığıyla örnek, sabit fazı barındıran katman veya kolondan geçer. Mobil faz sabit faz üzerinden ilerledikçe, çözünen maddeler ya sabit faza tutunur ve hareket etmeyebilir veya sabit faza hiç tutunmadan mobil fazla beraber hareket edebilir. Diğer bir seçenekte ise örnek her iki faz ile birden etkileşir ve iki faz arasında dağılım gösterir. Sabit faza ilgisi daha çok olan analitler daha yavaş göç ederken, az olanlar daha hızlı hareket ederler. Analitlerin mobil faza ilgisi arttıkça göç etme hızı artar. Kuvvetli bağlanan analitler, sabit fazdan ancak mobil fazın kimyasal özelliği değiştirilerek ayrılabilirler.

Düzlemsel kromatografi hakkında kısaca bilgi veriniz.

Düzlemsel kromatografide sabit faz bir kağıt yaprağa (kağıt kromatografi) veya katı yüzeye tutturulur (ince tabaka kromatografi). Kağıt kromatografide sabit faz suyun veya polar bir çözücünün kağıdın lişerine tutturulması sonucu oluşturulur. İnce tabaka kromatografide silika jel gibi partiküllerin ince tabaka halinde cam levha, plastik ya da aluminyum katmanlar üzerine düzgünce yayılarak kaplanması ile oluşturulur. İnce tabaka küçük çaplı partiküllerden şekillendiği durumlarda tekniğe yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi denilmektedir.

Kolon kromatografisi hakkında kısaca bilgi veriniz.

Kolon kromatografide, sabit faz saf silika veya polimer olabilir. Destek ortamına ya kaplanmakta ya da kimyasal şekilde bağlanmaktadır. Sabit faz tüp içine doldurulabilir veya tüp iç yüzeyine kaplanabilir. Hareketli fazın gaz ya da sıvı olmasına göre kolon kromatografi gaz veya sıvı kromatografi olarak adlandırılır. Her iki teknik kütle spektrometresi ile beraber kullanılırsa buna birleştirilmiş teknikler denir ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi veya sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tanımlarından bahsedilir. Hareketli faz, sabit faz içerisinden geçer. Bu sırada analitin kolondaki sabit fazla etkileşimleri sonucu, molekül özelliklerine göre bir sıralanma oluşur.

Kromatogram nedir?

Analitik gaz kromatografi veya sıvı kromatografide hareketli faz kolondan çıkar ve dedektörden geçerek; zamanın, mesafenin veya hacmin fonksiyonunda elektronik sinyal oluşturur. Elde edilen grafik kromatogram olarak adlandırılır.

Kromatografik ayırımın sınıflandırılması nasıl yapılmaktadır?

Kromatografik ayırımın sınıflandırılması, çözünen maddelerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre yapılmaktadır. Bunlar iyon değişim, bölümleme (partisyon), soğurma (adsorbsiyon), boyut dışlama (jel filtrasyon) ve affinite kromatografileridir. Klinik laboratuvar uygulamalarında en çok iyon değişim ve partisyon kromatografi teknikleri kullanılmaktadır.

İyon değişim kromatografisi hakkında kısaca bilgi veriniz.

İyon değişim kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun zıt yüküne sahip hareketli faz arasında iyonların yer değişimi esasına dayanır. Şartlara bağlı olarak çözünmüş maddeler ya katyon (artı yüklü) ya da anyon (eksi yüklü) olarak bulunurlar. Ayırım, taşınan yüklerin fark ve miktarına dayanır. İşlemsel olarak sabit faz olarak görev yapan silika parçacıkları veya reçinenin yüzeylerine, anyonik veya katyonik yükleri sağlayan fonksiyonel gruplar bağlanır. Elektrokimyasal nötrlüğü sağlamak için ters iyon (counter ion) olarak tanımlanan takas iyonu, sabit yüklere çok yakın konumda bulunur ve hareketli fazda yer alan çözünmüş iyonlar ters iyonlar ile yer değiştirirler.

Partisyon kromatografisi hakkında kısaca bilgi veriniz.

Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İşlemsel olarak sıvılardan bir tanesi sabit fazı oluşturur. Bu fazın oluşturulması için ince tabaka sıvı destek materyali üzerine veya kapiller kolonun iç yüzüne adsorbe edilir. Ayırım çözünen maddelerin sabit ve hareketli faz arasında göreceli çözünme yeteneğine bağlı olarak şekillenir.

Adsorpsiyon kromatografisi hakkında kısaca bilgi veriniz.

Adsorpsiyon kromatografinin esasını, çözünmüş maddelerin katı yüzeyde soğrulma (adsorpsiyon) ve salınma olayları arasındaki fark oluşturur. Elektrostatik hidrojen bağları ve dağılımsal etkileşimler bu tip kromatografiyi kontrol altında tutan faktörlerdir. Bu çalışma şekli ile gaz kromatografi kullanılarak düşük molekül ağırlık ve oda ısında gaz formunda olan moleküller birbirinden ayrılabilmektedir.

Boyut Dışlama Kromatografisi (Jel Filtrasyon) hakkında kısaca bilgi veriniz.

Bu kromatografi çeşidi aynı zamanda jel filtrasyon, moleküler eleme, sterik eleme ve jel nüfuz kromatografisi olarak da bilinmekte olup moleküllerin büyüklüklerine göre ayrımını sağlar. Molekülün şekli ve hidratize formda bulunması işlemin sonuçlarını etkilemektedir. 

Affinite kromatografi hakkında kısaca bilgi veriniz.

Affinite kromatografide analit ve bağlayıcı molekülün biribiri ile eşsiz bir biçimde bağlanması yöntemin esasını oluşturur. Enzim-substrat, hormon-reseptör veya antijen antikor etkileşimleri bu teknikte kullanılmaktadır.

İmmunokimyasal reaksiyonlar hakkında kısaca bilgi veriniz.

İmmunokimyasal reaksiyonlar, immunoassay olarak bilinen hassas ve özgül testlerin esasını oluşturmaktadır. Tipik bir immunoassayda analiti yani antijeni tanımak üzere, antikorlar ayıraç olarak kullanılmaktadır. Spesifik antijenlere karşı hazırlanmış yüksek özgüllük ve affinitedeki antikorların varlığı ve antikorların eşsiz bir biçimde antijenleri çapraz bağlama yeteneklerinin oluşu spesifik maddelerin identifikasyonunu ve miktarlarının belirlenmesini sağlamıştır.

Antikor nedir?

Organizmada antijenle uyarı sonrası plazma hücreleri tarafından üretilen ve yapısı sayesinde onlar ile özgün olarak reaksiyona girme kapasitesine sahip proteinlere antikor adı verilmektedir.

Imunojenite için gerekli özellikler nelerdir?

Imunojenite için gerekli özellikler aşağıda sıralanmıştır.

1. Molekül içinde kararlı yapıların var olması
2. Yapının rastlantısallığı
3. Molekül ağırlığının en az 4000-5000 Da olması
4. Metabolize olabilme yeteneği
5. Immunojenik konfigurasyonun antikor oluşturan mekanizmalara erişebilirliği
6. Yapısal olarak yabancılığı

Antijen-antikor bağlanmasına katkıda bulunan kuvvetler nelerdir?

Antijen-antikor bağlanması için birkaç farklı kuvvet birlikte hareket eder. Bu olaya katkıda bulunan bağlanma kuvvetleri; elektrostatik van der Waals-London dipol dipol etkileşimleri, hidrofobik etkileşimler ve iyonik kolombik bağlanmadır.

Kalitatif amaçlı kullanılan başlıca immunokimyasal yöntemler nelerdir?

Kalitatif amaçlı kullanılan başlıca immunokimyasal yöntemler pasif jel difüzyon, immunelektroforez ve Western blottur.

ELISA nedir?

Enzimle işaretli antijen ya da antikorun serbest antijen ya da antikor ile reaksiyona girmesi ve oluşan antijen antikor kompleksinin enzim aktivitesinin enzime spesifik substrat varlığında ortaya konması esasına dayanan ölçüm tekniğidir.

ELISA çeşitleri kaç grupta incelenir?

ELISA çeşitleri iki grupta incelenebilmektedir.

1. Yarışmalı teknikler

a) Antijen-enzim konjugatını kullanan teknik

b) Antikor-enzim konjugatını kullanan teknik

2. Yarışmalı olmayan teknikler

a) Çift antikor sandviç tekniği

b) Modifiye çift antikor sandviç tekniği

c) İndirekt teknik

Radyoligand yöntemlere örnek veriniz. 

Radyoligand yöntemlere örnek vermek gerekirse;

1. Radyoimmun yöntem (RIA)
2. Immunoradimetrik yöntem (IRMA)
3. Yarışmamalı (kompetetif) protein bağlama (CPB) yöntemi
4. Radyoreseptör analizi
5. Radyoenzimatik yöntem

başlıcalarıdır.

DNA polimeraz tarafından DNA sentezlenmesi için kullanılan yol göstericiye ne ad verilir? Kısaca bilgi veriniz.

DNA polimeraz tarafından DNA sentezlenmesi için kullanılan yol göstericiye primer denilir ve bu ortalama 20 bazdan oluşan sentetik DNA dizisidir. DNA polimeraz enzimi primerin serbest kalan 3-OH ucuna baz eşleşme kuralına uygun olarak nükleotidleri ilave eder.