Viroloji Dersi 6. Ünite Sorularla Öğrenelim

Svab (Sürüntü) örneklerinin hazırlanması nasıl olmalıdır? Maddeler halinde açıklayınız

? Transport vasatı veya PBS içerisinde laboratuvara gelen svab örnekleri öncelikle özel çalkalayıcılarda (vorteks) işlenir ve svab pamuğu tüpün duvarında sıkıştırılarak viruslu materyalin pamuktan sıvıya geçmesi sağlanır. Svab çubuğu otoklavlanarak atılır. ? Elde edilen viruslu sıvı materyal (+4)°C’de 3000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilir. ? Süpernatant başka bir tüpe alınarak antibiyotik ilavesi yapılır. Yukarıda açıklandığı şekilde kontaminasyon kontrolü yapıldıktan sonra inokulum olarak kullanılır. Zaman zaman idrardan da inokulum hazırlama ihtiyacı duyulabilir. Bu durumda idrar öncelikle santrifüj edilerek berraklaştırılır. Takiben PBS içerisinde 1:10 oranında sulandırılır, antibiyotik eklenip bakteriyel kontaminasyon yönünden kontrol edildikten sonra inokulum olarak kullanılabilir.

Serolojik Çalışmalarda Kullanılacak Kanın Hazırlanması nasıl gerçekleştirilir? Maddeler halinde açklayınız.

Serolojik çalışmalarda (antikor tespiti için) kullanılacak kan örnekleri katkısız steril tüplere veya silikonlu tüplere alınabilir. ? Tüplere alınan kan örnekleri pıhtılaşmayı takiben steril bir tel ile çizilir. Serum çıkması için (+4)°C’de 1 gece veya oda sıcaklığında birkaç saat bekletilir. Daha hızlı serum çıkışı için çizilen kan örnekleri (+4)°C’de 3000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilebilir. ? Açığa çıkan serum pastör pipeti ve puvar yardımıyla steril bir stok tüpüne alınarak 56°C’ye ayarlanmış su banyosunda 30 dk süreyle inaktive edilir. Buradaki temel amaç serum örneklerindeki komplementin inaktive edilmesidir. Hazırlanan serum örnekleri test edilinceye kadar (-20)°C’de dondurularak muhafaza edilebilir.

Virus partikülünün tespiti nasıl yapılır?

Virus partikülünün tespiti viruslu materyallerin elektron mikroskopta incelenmesiyle yapılabilir. Bu yaklaşım özellikle hücre kültüründe üretilmesi zor olan virusların hızlı teşhisi için tercih edilmektedir.

Viral hastalıkların laboratuvar teşhisinde hangi prensipler takip edilmelidir?

Viral hastalıkların laboratuvar teşhisi virusa ait yapıların veya virusa spesifik antikorların gösterilmesiyle yapılabilir. Bu amaca yönelik olarak aşağıda sıralanan temel prensipler takip edilmektedir: ? 1.Virus partikülünün tespiti ? 2.Virus izolasyonu ve identifikasyonu ? 3.Viral antijenlerin tespiti ? 4.Viral nükleik asit tespiti (moleküler yöntemler) ? 5.Virusa spesifik antikorların tespiti (serolojik yöntemler) Bu prensiplerden ilk dördünde direkt olarak etkeni tanımlayarak teşhise gidilirken, beşinci prensip virusa karşı oluşmuş antikorların tanımlanmasıyla viral hastalıkların indirekt teşhisine olanak sağlamaktadır.

İmmuno-capture ELISA Yönteminde hangi basamaklar takip edilir?

? Kuyucuklar aranan antijene spesifik olduğu bilinen antikorlarla kaplanır. ? İnkübasyonu takiben yıkama yapılır ve kuyucuklara antijen (veya virüslü materyal) konulur. Tekrar inkübasyon ve yıkama aşamaları uygulanır. fiüpheli materyaldeki antijen kuyucukta bulunan spesifik antikora bağlanacak ve yıkamayla uzaklaşmayacaktır. ? Yıkama işlemini takiben gözlere, farklı bir canlı türünde elde edilmiş olan sekonder antikor konulur. İnkübasyon ve yıkama işlemleri yapılır. ? Test gözlerine sekonder antikoru tanıyan bir konjugat konulur. İnkübe edilir ve yıkama uygulanır. ? Konjugatın taşıdığı enzime uygun bir substrat solüsyonu konulur. ? İnkübasyonu takiben reaksiyon durdurulur ve spektrofotometrede okutulup optik dansite (OD) değerleri belirlenerek sonuçlar değerlendirilir.

Virolojik teşhisin önemini kısaca açıklayınız.

Birçok hastalıkta viruslar vücuttan çok kısa bir dönem içerisinde saçılır. Bununla birlikte virus partiküllerinin çevre şartlarına oldukça duyarlı olmaları virus teşhisini sınırlandıran önemli bir faktördür. Bu sebeple virolojik teşhis amacıyla örneklemelerin doğru zamanda ve uygun bir şekilde yapılması, teşhis için uygun materyallerin alınması ve amaca uygun olarak doğru laboratuvara gönderilmesi önem taşımaktadır.

Virüs izolasyonu ne anlama gelmektedir?

Sahadan alınan örneklerden yapılan ekimlerle virusun üretilmesine virus izolasyonu adı verilir. Bu işlem sonucunda üretilerek elde edilen yeni virus suşuna ise izolat denir. Virus izolatlarının elde edilmesini takiben adlandırılması (identifikasyon) yapılır. Bu basamakta virusun fiziko-kimyasal özellikleri, hiperimmun serumla yapılan serolojik testler ve aranan virusa spesifik tanımlayıcı immuno-histokimyasal ve moleküler yöntemlere (PCR vb) başvurulur.

Pipetleme ne anlama gelmektedir?

Pipetleme (pipetasyon), katı bir maddeyi sıvı bir madde içinde eritmek veya homojen olarak karıştırarak süspansiyon haline getirmek üzere pipet yardımıyla çekmeboşaltma işlemlerinin birbiri ardına yapılmasını ifade eder. Bu işlem aynı zamanda birden fazla sıvı maddeyi homojen olarak karıştırabilmek amacıyla da uygulanabilir.

Organ ve dışkı örnekleri testlere nasıl hazırlanmalıdır? Maddeler halinde açıklayınız.

? Uygun şekilde laboratuvara aktarılan organ ve dışkı örnekleri antibiyotikli PBS içerisinde 1:10 oranında (1g / 9 ml) sulandırılır. ? Homojenizatörde veya steril havanda ezilerek homojen hale getirilir. Bu işlem havanda yapılıyorsa ortama bir miktar steril kum ilave edilerek homojenizasyon kolaylaştırılır. ? Elde edilen homojenat tülbentli beher glass’dan süzülerek kaba partikülleri ayrılır. Alttaki süzüntü santrifüj tüpüne alınır, (+4)°C’de 3000 devir/dakika hızda 10 dakika santrifüj edilir. ? Süpernatant pastör pipeti yardımıyla başka bir tüpe alınır ve konsantre antibiyotik (penisilin ve streptomisin) ilave edilir. ? Antibiyotiğin etkimesi için 1 saat oda sıcaklığında veya 1 gece (+4)°C ‘de bekletildikten sonra agara ekilerek bakteri kontaminasyonu yönünden kontrol edilir. Ekim yapılan agarlar 37°C’de 24-48 saat süreyle takibe alınır. Bu süreçte inokulum (- 20)°C veya daha düşük bir ısıda dondurularak muhafaza edilmelidir. Agar kontrolünde bakteri üremesi gözlenmeyen örnekler hücre kültürüne ekim için hazırdır.

Örneklerin nakledilmesi nasıl gerçekleştirilir? Kısaca açıklayınız.

Örneklenen teşhis materyallerinin nakledilmesi mutlaka soğuk zincir altında ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Bu ortam, araçta bulunan bir soğutucu ile sağlanabileceği gibi aynı amaçla kuru buz, buz aküsü veya buz torbalarıyla desteklenmiş nakil termosları da kullanılabilir. Özellikle solunum sistemi enfeksiyonlarında alınan doku örnekleri ve virus izolasyonu amacıyla antikoagulanlı tüplere alınan kan örnekleri kesinlikle dondurulmadan nakledilmelidir. Serum örnekleri ise tüpe alındıktan sonra soğuk zincir altında gönderilebileceği gibi, pıhtı ayrılıp serum steril bir tüpe aktarıldıktan sonra gönderilebilir veya dondurularak saklanabilir. Pıhtıdan ayrılan serum örnekleri dondurularak saklanabilir.

Hemaglütinasyon Testi (HA) nedir?

Virion yapısında hemaglütinin glikoproteini taşıyan virusların belli canlı türlerine ait eritrositleri bağlayarak kümeleştirmesi ve çöktürmesine hemaglütinasyon adı verilir. Genellikle zarşı viruslarda görülen bir özellik olmasına karşın adenoviruslar ve reoviruslar gibi zarfsız viruslar da hemaglütinasyon yeteneğine sahiptir.

İnokulumun Bakteriyel Kontaminasyondan Arındırılması nasıl gerçekleştirilir?

Örneklerin hazırlanması sırasında streptomisin ve penisilin gibi geniş spektrumlu antibiyotikler kullanılır. Bu antibiyotik çözeltileri genellikle inokulumdaki bakteriyel kontaminasyonu elimine etmeye yeterlidir. Agara ekim sonrasında bakteri üremesi görüldüğü durumlarda inokuluma farklı bir antibiyotik ilave edilebilir veya inokulum 220 nm por büyüklüğüne sahip enjektör filtrelerden süzülür.

Virus izolasyonu İçin kullanılacak kanın hazırlanması nasıl gerçekleştirilir? Maddeler halinde açıklayınız.

Virus izolasyonu amacıyla kullanılacak kan örnekleri antikoagulan madde içeren bir tüpe alınmalıdır. Bu amaçla EDTA, sodyum sitrat veya heparin katkılı tüpler kullanılabilir. ? Antikoagulanlı tüplere alınan kan örnekleri (+4)°C’de 1000 devirde 10 dakika süreyle santrifüj edilir. ? Santrifüj sonunda kan 3 tabakaya ayrılır. Tüpün en alt bölümünde eritrositler, üst bölümünde plazma yer alır. Löykositler ise bu iki bölümün arasında gri-beyaz renkli bir bölge halinde yer alacaktır. ? Pastör pipeti ile girilerek löykosit tabakası çekilir, 2 ml PBS içerisine alınır ve pipetlenerek homojenize edilir. ? Aynı koşullarda tekrar santrifüj edilerek löykosit tabakası ayrılır. Bu işleme 3 kez devam edilir. Mümkün olduğunca saf (eritrosit ve plazmadan arınmış) löykosit elde etmeyi amaçlayan bu işlem “löykosit yıkama” olarak tanımlanır. ? Son yıkamayı takiben löykositler 1 ml PBS içerisine alınır ve %10’u oranında dimetil sülfoksit (DMSO) ilave edildikten sonra (- 80)°C’de dondurularak muhafaza edilir.

Otoliz ne anlama gelmektedir?

Otoliz, ölümden sonra dokuların herhangi bir dış faktörün etkisi olmaksızın kendi enzimleriyle tahrip olması ve erimesine otoliz adı verilir. Bu olaya değişik mikroorganizmaların da katılması durumunda kokuşma (putrifikasyon) şekillenir.

Nötralizasyon testinin başlıca kullanım alanları nelerdir?

? Aşılama öncesi ve sonrasında bağışıklık düzeylerinin belirlenmesi ? Epidemiyolojik çalışmalar ? Sürü bazında belirli hastalıkların kontrol, takip ve eradikasyonu ? Virus identifikasyonu ? Viruslar arasındaki serolojik yakınlıkların belirlenmesi

Viral teşhis amacıyla laboratuvara iletilen örneklerin test edilmeden önce neler yapılmalıdır?

Viral teşhis amacıyla laboratuvara iletilen örneklerin test edilmeden önce bazı hazırlık aşamalarından geçirilmesi gerekir. Buradaki başlıca amaç hücre kültürüne ekim için virusu şüpheli materyalden steril izotonik bir sıvı ortama almak, bakteri ve mantar kontaminasyonlarını elimine etmek ve hücre kültüründe oluşabilecek toksik etkiyi en aza indirmektir. Hücre kültürüne ekim (inokulasyon) için hazır hale getirilen teşhis materyaline inokulum denir.

Viral Antijenlerin tespitinde kullanılan yöntemleri kısaca açıklayınız.

Viral enfeksiyonlarda virusa ait antijenik yapıların tespiti yoluyla yapılacak olan teşhis çalışmaları iki şekilde yürütülebilir. Bunlardan ilki direkt olarak enfekte doku materyallerinde virus antijenlerinin gösterimi, diğeri ise bu materyallerden hazırlanan inokulumun ekildiği hücre kültürlerinde virus antijenlerinin gösterimi esasına dayanır. Bu amaçla kullanılan yöntemlerin birçoğunda konjugat adı verilen işaretli antikorlar kullanılır.

Virus izolasyonu ve identifikasyonu kısaca açıklayınız

Virus izolasyonu ve identifikasyonu viral hastalıkların kesin tanısı için en güvenilir yol olarak gösterilmektedir. Ancak virus izolasyon çalışmalarının genel olarak zaman alıcı ve zahmetli olması özellikle rutin teşhis çalışmalarında sorun yaratabilir. Virus izolasyonu için deneme hayvanı veya embriyolu tavuk yumurtaları da kullanılabilmesine karşın en çok başvurulan canlı sistemler hücre kültürleridir. Bu amaçla teşhis materyallerinden hazırlanan inokulumlar hücre kültürlerine adsorbsiyonlu yöntemle ekilir ve kör pasajlar yapılarak virus üremesine bağlı değişiklikler günlük kontrollerle takip edilir. Sitopatojen virusların bu kültürlerde oluşturdukları morfolojik değişimler mikroskobik incelemelerde saptanabilir. Sitopatojen olmayan virusların üremesinin tespiti ise özel teknikler (immunofloresan testi, immunoperoksidaz testi vb.) kullanılarak yapılabilir.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) yöntemini kısaca açıklayınız.

ELISA yüksek duyarlılığa sahip bir yöntem olması, hücre kültürü kullanımının gerekli olmaması ve hızlı teşhise olanak sağlaması gibi nedenlerle rutin teşhis çalışmalarında en sık başvurulan yöntemlerden birisidir. ELISA’ da kullanılan konjugat peroksidaz veya alkalin fosfataz enzimlerinin birisiyle işaretlenmiştir. Aranan antijene bağlanan bu konjugat daha sonra eklenen substratı indirgeyerek renk değişimine neden olur. Meydana gelen renk değişikliğinin yoğunluğu spektrofotometrede ölçülerek testin değerlendirmesi yapılır. ELISA tekniğinin analitik duyarlılığı oldukça yüksektir ve örnekte aranan maddeyi 0,5 ng/ml’ye kadar düşük yoğun- luklarda bile tespit edebilir.

Konjugat nedir?

Aranan antijene özgün olduğu bilinen ve bir enzim, boya maddesi veya bir radyoaktif madde ile işaretlenmiş olan antikorlara konjugat adı verilir.

Substrat ne anlama gelir?

Enzimlerle reaksiyona giren ve kimyasal tepkime sonrasında sentezlenen veya ayrışan maddelere substrat adı verilir.

Antikoagulan madde nedir?

Kanın pıhtılaşmasını engelleyen kimyasal maddelere antikoagulan madde adı verilir. Pratikte en çok kullanılan antikoagulan madde etilen diamin tetra asetik asitin potasyum tuzudur (EDTA K3). Bunun dışında sodyum sitrat, potasyum sitrat ve heparin de aynı amaçla kullanılmaktadır.

Transport vasat ne anlama gelmektedir? Kısaca açıklayınız.

Transport vasatı, teşhis materyallerinin nakledilmesinde kullanılmak üzere hazırlanmış steril izotonik sıvı veya yarı katı ortamlardır.

Epidemik hastalık ne anlama gelir?

Epidemik hastalık, yayılma hızı oldukça yüksek olan ve bölgeler arasında yayılma eğilimi gösteren hastalıklara epidemik hastalık denir. Bu özelliğe sahip hastalıkların ortaya çıkması olayı ise epidemi olarak tanımlanır.

Örnekleme yapan kişi nelere dikkat etmelidir?

Örneklemeyi yapan kişi kendi sağlığı ve halk sağlığıyla birlikte teşhis materyallerinin gönderilmesi sırasında materyalden kaynaklanabilecek çevresel kontaminasyonları da dikkate almalı, uygulamadaki mevzuatı göz önünde bulundurmalıdır. Laboratuvara teşhis amaçlı materyal gönderilirken gerekli bilgileri içeren bir bilgi formu da mutlaka eklenmelidir.

Soğuk zincir ne anlam ifade eder?

Soğuk zincir, bir maddenin sahip olduğu özelliklerini koruyabilmesi için kaynağından başlayarak nakledileceği yere kadar uygulanması zorunlu olan muhafaza ve taşıma koşullarını ifade eder. Biyolojik maddelerin kısa süreli nakilleri ortam ısısının +2 ile +8°C arasında sabit tutulması ile yapılabilir. Bazı biyolojik maddelerin nakledilmesinde ise soğuk zincir şartlarının (- 20°C) olması gereklidir.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) uygulama protokolleri nelerdir?

ELISA’ya ilişkin çok değişik uygulama protokolleri geliştirilmiş olmakla birlikte bu protokoller indirekt ELISA, yarışmalı ELISA, sandviç ELISA ve immun-capture ELISA yöntemleri olarak gruplandırılabilir. İndirekt ELISA ve yarışmalı ELISA yöntemleri antikor tespiti için kullanılırken sandviç ELISA ve immun-capture ELISA yöntemleri antijen tespiti amacıyla kullanılır.

İmmunofloresan Tekniğini kısaca açıklayınız

Floresan Antikor Tekniği (FAT) olarak da bilinen bu teknikte kullanılan konjugat enzim yerine değişik boya maddeleri ile işaretlenmiştir. Bu boyalar ultraviyole ışık (360nm) kaynağından aldıkları ışığı belirli dalga boylarında yayarak ışıldama oluştururlar. Bu amaçla en çok kullanılan boya maddeleri floresein izotiyosiyanat (FITC) veya rodamin’ dir. Genellikle tercih edilen FITC konjugatları pozitif örneklerde sarı-yeşil bir ışıldama oluştururlar. Dolayısıyla virusla enfekte olan hücreler enfekte olmamış hücrelerden ayırt edilebilir. Testin değerlendirilmesi floresan mikroskop adı verilen özel düzeneğe sahip mikroskopta yapılır. Sonuçların çok kısa sürede alınabilmesi immunofloresan testi için en önemli avantajdır. Direkt IF prosedüründe kullanılan konjugat aranan antijene spesifiktir. İndirekt yöntemde ise antijene öncelikle belli bir hayvan türünde (örneğin tavşanda) elde edilmiş olan anti-virus antikorları (sekonder antikor) bağlanır. Konjugat bu antikora spesifiktir ve başka bir hayvan türünde elde edilen anti-antikorlar ile hazırlanmıştır.

İndirekt İmmunofloresan Tekniği (IFAT) nasıl gerçekleştirilir?

Bu yöntemde izlenen prosedür floresan antikor tekniği ile antijen aranmasında izlenen indirekt yöntemle aynıdır. Ancak IFAT protokollerinde hücreler bilinen virus ile enfekte edildikten sonra şüpheli serum örnekleri reaksiyona sokulur. Test sonucunda boyanan hücrelerin görülmesi serum örneğinde aranan antikorların varlığına işaret eder.

İmmunoperoksidaz yönteminden kısaca bahsederek avantaj ve dezavantajlarını açıklayınız.

Peroksidaz Bağlı Antikor Tekniği (PLA) olarak da bilinen bu teknikte konjugat olarak peroksidaz enzimi (horse radish peroksidaz, HRPO) ile işaretli antikorlar kullanılır. Enfekte hücre kültürleri veya enfekte dokulardan hazırlanan ince kesit preparatlar öncelikle bu konjugatla muamele edilir. Takiben substrat çözeltisi ilave edilir. Reaksiyonun pozitif olduğu durumlarda enfekte hücrelerde hücre içi boyanma görülür (fiekil 6.8; Resim 6.3). Bu yöntem maliyetinin düşük oluşu ve sonuçların invert ışık mikroskobunda değerlendirilebilmesi gibi avantajlara sahiptir. Ancak ELISA ile kıyaslandığında hücre kültürüne bağımlı bir test olması, steril çalışma şartlarını gerektirmesi ve gözle değerlendirilmesi gibi dezavantajları bulunmaktadır.

Hemaglütinasyon inhibisyon nedir? Kısaca açıklayınız.

Hemaglütinasyon yeteneğine sahip virusların bu özelliklerinin spesifik antikorlar tarafından bloke edilmesi hemaglütinasyon inhibisyon olarak tanımlanır. Bu amaçla öncelikle şüpheli serum örneğinin 2 katlı (Log2) sulandırmaları hazırlanır ve test virusuyla karşılaştırılır. fiüpheli serumda test virusuna karşı antikorlar varsa bu aşamada bağlanma gerçekleşir. İnkübasyonu takiben ortama eritrosit süspansiyonu eklenir ve hemaglütinasyona bırakılır. İlk aşamada test virusu antikorlar tarafından bağlanmışsa, ikinci aşamada eklenen eritrositleri aglütine edemez. Dolayısıyla hemaglütinasyonun oluşmaması (düğme tarzındaki çöküntü) süpheli serumda aranan antikorların varlığını gösterir. Test formatı virus veya antikor aranmasına veya kantitatif olarak hemaglütinasyonu inhibe eden antikor titresinin saptanmasına yönelik olarak düzenlenebilir.

Hemaglütinasyon testi kaç şekilde uygulanır?

Oldukça basit, ekonomik ve saha şartlarında uygulanabilir bir yöntem olan hemaglütinasyon testi lam üzerinde yapılan hızlı hemaglütinasyon testi ve tüpte (veya pleytte) yapılan yavaş hemaglütinasyon testi olmak üzere iki şekilde uygulanabilir. Hızlı hemaglütinasyon testi, Virus ve eritrositler bir lam üzerinde karıştırılarak kısa süre içinde sonuç alınır. Yavaş hemaglütinasyon testi: ? Öncelikle virusun 2 katlı (Log2 tabanında) sulandırması hazırlanır. ? Takiben tüm gözlere eritrosit süspansiyonu eklenir ? +4 °C de 30 dk beklemeyi takiben değerlendirme yapılır.

Nötralizasyon nedir? Kısaca açıklaynız.

Bir virusun enfeksiyon oluşturabilme yeteneğinin spesifik (homolog) antikorlar tarafından in vivo veya in vitro şartlarda bloke edilmesine nötralizasyon denir.

Optik Dansite ne anlama gelir?

Optik dansite, bir cismin veya süspansiyon halindeki bir sıvının, üzerine uygulanan ışığı ne kadar tuttuğunun veya yansıttığının ölçüsüdür. ELISA uygulamalarında test gözünde oluşan renk ne kadar yoğun ise ışık geçirgenliği o kadar azalacak, dolayısıyla optik dansite değeri yükselecektir.

Sekonder antikor ne anlama gelmektedir?

Sekonder antikor, bir canlı türüne ait olan antikorların başka bir canlı türüne verilmesiyle elde edilen ikincil antikorlardır.

Sandviç ELISA yönteminde hangi basamaklar takip edilmelidir?

? Kuyucuklar aranan antijene spesifik olduğu bilinen antikorlarla kaplanır. ? İnkübasyonu takiben yıkama yapılır ve kuyucuklara antijen (veya virüslü materyal) konulur. Tekrar inkübasyon ve yıkama aşamaları uygulanır. fiüpheli materyaldeki antijen kuyucukta bulunan spesifik antikora bağlanacak ve yıkamayla uzaklaşmayacaktır. ? Yıkama işlemini takiben test gözlerine aranan antijene spesifik konjugat konulur. ? Tekrar inkübe edilir ve yıkama basamağından sonra konjugatın taşıdığı enzime uygun bir substrat solüsyonu konulur. ? İnkübasyonu takiben ortama asit çözeltisi ilave edilerek reaksiyon durdurulur (Resim 6.2) ve spektrofotometrede okutulup optik dansite (OD) değerleri belirlenerek sonuçlar değerlendirilir.

Viral Nükleik Asit tespitinde kullanılan Yöntemler nelerdir?

Moleküler biyoloji yöntemleri viral etkenlerin şüpheli materyalden yüksek duyarlılıkla ve hızlı tespitine olanak sağlamaktadır. Ayrıca bu yöntemler hücre kültürlerinde üretilmesi zor olan bazı virusların tanımlanmasına olanak sağlamaları açısından da önemli bir yer tutar. Virolojik teşhis çalışmalarında en sık kullanılan moleküler yöntemler arasında elektroforezis, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve hibridizasyon teknikleri sayılabilir.

İndirekt ELISA Yönteminde hangi basamaklar takip edilir?

Bu testin uygulanmasında aşağıdaki basamaklar takip edilir: ? ELISA pleytinin kuyucukları öncelikle konsantre edilmiş virusla veya viral antijenlerle kaplanır. ? İnkübasyon ve yıkamayı takiben kuyucuklara şüpheli serum örneği konularak inkübe edilir. Serumdaki spesifik antikorlar yüzeye kaplanan antijene bağlanacak ve yıkamayla uzaklaşmayacaktır. ? Üçüncü aşamada, tekrar yıkama yapılır ve antikorları tanıyacak tür spesifik bir konjugat eklenir (örneğin sığır serumunda çalışıyorsak enzim işaretli anti-sığır antikorları kullanılır). ? Tekrar inkübe edilen pleytlere yıkama uygulandıktan sonra konulan substrat, konjugatın taşıdığı enzim tarafından indirgenerek renk değişimine neden olur. ? Kısa bir inkübasyonu takiben ortama asit çözeltisi ilave edilerek reaksiyon durdurulur. Spektrofotometrede optik dansite (OD) değerleri belirlenerek sonuçlar değerlendirilir. ELISA günümüzde bir çok viral etkene spesifik antikorların tespiti amacıyla rutin olarak kullanılmaktadır.

Nötralizan antikor nedir?

Nötralizan antikor, Virusa bağlanarak enfeksiyon oluşturma yeteneğini bloke eden antikorlara nötralizan antikor denir. Bu antikorlar virusun konak hücreye tutunmasına olanak sağlayan epitoplarına karşı oluşmuştur. Diğer epitoplara karşı oluşan antikorlar virusa bağlanmasına karşın nötralizasyon yapamazlar.

Perisipitasyon ne anlama gelmektedir?

Antijen ile bu antijene karşı oluşmuş antikorların birleşmesi sonucunda oluşan kompleksin belirli bir bölgede birikerek sabit kalmasıdır.

Agar jel immunodifuzyon testi nasıl gerçekleştirilir?

Agar jel immunodifuzyon testi, agar içerisinde hazırlanan farklı kuyucuklara konulan antikorlar ve konsantre antijenin yarı katı bir ortam olan jel içine yayılarak karşılaşması ve birleşip çökelerek gözle görülebilir bir hat (perisipitasyon hattı) oluşturması esasına dayanır.

Otoliz nedir?

Ölümden sonra dokuların herhangi bir dış faktörün etkisi olmaksızın kendi enzimleriyle tahrip olması ve erimesine otoliz adı verilir.

Kokuşma (putrifikasyon) nasıl oluşur?

Otoliz olayına değişik mikroorganizmaların da katılması durumunda kokuşma (putrifikasyon) oluşur.

Antikoagulan madde nedir?

Kanın pıhtılaşmasını engelleyen kimyasal maddelere antikoagulan madde adı verilir.

En çok kullanılan antikoagulan madde nedir?

Pratikte en çok kullanılan antikoagulan madde etilen diamin tetra asetik asitin potasyum tuzudur (EDTA K3). Bunun dışında sodyum sitrat, potasyum sitrat ve heparin de aynı amaçla kullanılmaktadır.

Transport vasatı nedir?

Teşhis materyallerinin nakledilmesinde kullanılmak üzere hazırlanmış sterilizotonik sıvı veya yarı katı ortamlardır.

Özel transport vasatı bulunamadığı durumlardane yapılmalıdır?

Özel transport vasatı bulunamadığı durumlarda antibiyotikli steril fizyolojik tuzlu su kullanılabilir.

Epidemik hastalık nedir?

Yayılma hızı oldukça yüksek olan ve bölgeler arasında yayılma eğilimi gösteren hastalıklara epidemik hastalık denir.

Soğuk zincir nasıl sağlanır?

Soğuk zincir bir maddenin sahip olduğu özelliklerini koruyabilmesi için kaynağından başlayarak nakledileceği yere kadar uygulanması zorunlu olan muhafaza ve taşıma koşullarını ifade eder.Biyolojik maddelerin kısa süreli nakilleri ortam ısısının +2 ile +8°C arasında sabit tutulması ile yapılabilir. Bazı biyolojik maddelerin nakledilmesinde ise soğuk zincir şartlarının (-20°C) olması gereklidir.

Viral teşhis amacıyla laboratuvara iletilen örneklerin test edilmeden önce hazırlık aşamaları nelerdir?

 Hücre kültürüne ekim için virusu şüpheli materyalden steril izotonik bir sıvı ortama almak, bakteri ve mantar kontaminasyonlarını elimine etmek ve hücre kültüründe oluşabilecek toksik etkiyi en aza indirmektir.

İnokulum nedir?

Hücre kültürüne ekim (inokulasyon) için hazır hale getirilen teşhis materyaline inokulum denir.

Pipetleme nedir?

Katı bir maddeyi sıvı bir madde içinde eritmek veya homojen olarak karışırarak süspansiyon haline getirmek üzere pipet yardımıyla çekme-boşaltma işlemlerinin birbiri ardına yapılmasını ifade eder. Bu işlem aynı zamanda birden fazla sıvı maddeyi homojen olarak karıştırabilmek amacıyla da uygulanabilir.

Löykosit yıkama nedir?

Santrifüj edilerek löykosit tabakası ayrılır. Bu işleme 3 kez devam edilir. Mümkün olduğunca saf (eritrosit ve plazmadan arınmış) löykosit elde etmeyi amaçlayan bu işlem “löykosit yıkama” olarak tanımlanır.

Svap (sürüntü) örnekleri nasıl hazırlanır?

•Transport vasatı veya PBS içerisinde laboratuvara gelen svab örnekleri öncelikle özel çalkalayıcılarda (vorteks) işlenir ve svab pamuğu tüpün duvarında sıkıştırılarak viruslu materyalin pamuktan sıvıya geçmesi sağlanır. Svab çubuğu otoklavlanarak atılır.

•Elde edilen viruslu sıvı materyal (+4)°C’de 3000 devir/dk hızda 10 dk santrifüj edilir.

•Süpernatant başka bir tüpe alınarak antibiyotik ilavesi yapılır.  Kontaminasyon kontrolü yapıldıktan sonra inokulum olarak kullanılır.

Viral hastalıkların laboratuvar teşhisinde temel prensipler nelerdir?

1.Virus partikülünün tespiti

2.Virus izolasyonu ve identifikasyonu

3.Viral antijenlerin tespiti

4.Viral nükleik asit tespiti (moleküler yöntemler)

5.Virusa spesifik antikorların tespiti (serolojik yöntemler)

Virus partikülünün tespiti nasıl yapılır?

Virus partikülünün tespiti viruslu materyallerin elektron mikroskopta incelenmesiyle yapılabilir. Bu yaklaşım özellikle hücre kültüründe üretilmesi zor olan virusların hızlı teşhisi için tercih edilmektedir.

Konjugat nedir?

Aranan antijene özgün olduğu bilinen ve bir enzim, boya maddesi veya bir radyoaktif madde ile işaretlenmiş olan antikorlara konjugat adı verilir.

Substrat nedir?

Enzimlerle reaksiyona giren ve kimyasal tepkime sonrasında sentezlenen veya ayrışan maddelere substrat adı verilir.

ELISA neden en sık baş vurulan yöntemlerden birisidir?

ELISA yüksek duyarlılığa sahip bir yöntem olması, hücre kültürü kullanımının gerekli olmaması ve hızlı teşhise olanak sağlaması gibi nedenlerle rutin teşhis çalışmalarında en sık başvurulan yöntemlerden birisidir.

Nötralizasyon testinin başlıca kullanım alanları nelerdir?

•Aşılama öncesi ve sonrasında bağışıklık düzeylerinin belirlenmesi

•Epidemiyolojik çalışmalar

•Sürü bazında belirli hastalıkların kontrol, takip ve eradikasyonu

•Virus identifikasyonu

•Viruslar arasındaki serolojik yakınlıkların belirlenmesi

Agar jel immunodifuzyon testi hangi durumlarda kullanılır?

Pratikte sığır löykozu ve bazı lentivirus enfeksiyonlarının (visna-maedi, caprine arthritis encephalitis, atların enfeksiyöz anemisi) serolojik teşhisinde kullanılmaktadır.