Veteriner Laboratuvar Teknikleri ve Prensipleri Dersi 5. Ünite Özet

Spektroskopi

Spektroskopi, maddelerin ışıkla olan etkileşimlerini çalışan, maddelerin soğurduğu ve yaydığı ışığı veya daha genel bir ifadeyle elektromanyetik dalgaları tespit ederek maddenin yapısı hakkındaki temel özellikler hakkında fikir elde edilmesine yardımcı olan tekniktir. Spektroskopi üç ana başlık altında incelenebilir.

• Ultraviyole ve Görünür Spektroskopi
• Floresans Spektroskopi
• Atomik Spektroskopi

Bir kimyasal maddenin ultraviyole ve görünür spektroskopisinde tanınabilmesi için bu bölgedeki ışıkla etkileşen kromofor denilen grupların varlığına ihtiyaç vardır. Bu bölgedeki spektroskopik yöntemler başlıca olarak, spektrofotomertri, türbidimetri ve nefelometridir.

Spektrofotometri, bir maddenin dalga boyu cinsinden ışığı yansıtma veya geçirme özelliklerine dayanarak miktarca ölçülmesidir. Spektrofotometri, görünür bölge ve bunun her iki yanında yer alan yakın mor ötesi ve yakın kızıl ötesi bölgeleri kapsamaktadır. Spektrofotometrik ölçümlerde kullanılan spektrofotometre denilen cihazlar ışın demetini yarık ya da prizma vasıtasıyla seçici biçimde numuneye gönderirler. Spektrofotometrelerin en önemli özellikleri spektral bant genişlikleri ile yansıma veya soğurma miktarlarının doğrusal olmasıdır. Bu doğrusallık ölçülen maddenin konsantrasyonu ile elde edilen absorbans arasında ilişkiyi doğurarak madde miktarı tayininde önemli bir yere getirmiştir bu cihazları. Madde miktarı dışında metot geliştirmeye yönelik bir çalışma olan saf çözeltilerin soğurma spektrumunun belirlenmesi amacıyla da spektrofotometrelerden yararlanılır. Bu cihazlar genel yapı itibarıyla bir ışık kaynağı, gelen ışığı monokromatik ışığa dönüştüren içinde prizma olan monokromatör ve bu ışığın örnekten geçtikten sonra ulaştığı detektörden oluşur. Spektrofotometrelerde temel prensip Lambert-Beer yasası ile açıklanmaktadır. Buna göre;

1. Çözelti üzerine gelen ışık ile çıkan ışık arasında matematiksel bir ilişki vardır.
2. Absorbans, soğuran maddenin konsantrasyonu ve çözeltiden geçen ışığın kat ettiği mesafenin uzunluğu ile doğru orantılıdır.
3. Ölçülen maddenin konsantrasyonu ile absorbans değeri arasında doğrusal bir ilişki vardır. Konsantrasyon arttıkça absorbans artar. Bu anlatılanlar aşağıdaki formül ile gösterilir:

A = ?dc

A = Absorbans,

? = molar ekstinksiyon sabiti,

d = cm cinsinden ışığın çözeltide kat ettiği mesafe

c = molar konsantrasyon’u gösterir.

Absorbsiyon spektroskopi yöntemi ile ölçülemeyecek kadar büyük partiküller içeren çözeltilerde ışığın kırılması, ışığın çözeltideki parçalar ile etkileşimini ölçen en uygun yöntemler turbidimetri ve nefelometridir. Bu ölçümler, partikül büyüklüğü, dalga boyu, gözlem noktasına uzaklık ve parçacıkların konsantrasyonuna bağlıdır. Kimyasal analiz, ışığın ortamdan geçerken kırılım sonucunda şiddetinin azalması esasına dayanmaktadır. türbidimetride, geçen ışığın yani kırılmaya uğramayan ışığın şiddeti ölçülmektedir. Nefelometride ise kırılan ışık ölçülmektedir. Türbidite rutin analizörler ile spektrofotometrik olarak (soğurulan ışık) ölçülebilirken, nefelometrik ölçüm için özel tasarlanmış cihazlara ihtiyaç duyulmaktadır. Nefelometride sonuçların hassasiyet ve doğruluğu daha yüksektir. Nefelometri, çeşitli açılarda saçılan ışığın bölümlerini tespit eder. Bu yöntemin hassasiyeti kör veya arka plan saçılımın varlığına bağımlıdır. İdeal olarak saçılım yapacak partiküllerin mutlak yokluğunda hiçbir ışık tespit edilmemelidir.

Floresans spektroskopisi, maddenin üzerine gelen elektromanyetik ışıma ile uyarılması ve temel haldeki elektronların uyarılmış enerji seviyesine geçmesi, daha sonra bu seviyede kararlı kalamadıklarından, tekrar temel enerji düzeyine geri dönmeleri ve bu esnada ortama verdiği ışımanın ölçülmesi ilkesine dayanmaktadır. Atomda aynı yörüngede bulunan elektronlar, birbirine zıt yönde veya aynı yönde dönebilirler. Bir atomda aynı yörüngede bulunan elektronlar birbirinin aksi yönünde hareket ediyor ise buna temel singlet; uyarıldığında aksi yönde hareket etmeye devam edip üst yörüngeye geçerse uyarılmış singlet denmektedir. Bir atomun iki farklı yörüngesinde aynı yönde dönen birer elektron varsa buna temel triplet denir. Temel triplet durumundan uyarılmış triplet durumuna geçiş elektronun bir üst yörüngeye çıkması sonucu görülür. Uyarılmış singlet sistemden, temel haldeki singlet sisteme geçiş sırasında yayılan ışığa fluoresans; uyarılmış triplet sistemden temel haldeki singlet bir sisteme geçiş sırasında yayılan ışığa ise fosforesans adı verilmektedir.

Metal iyonlarının analizi, bunların oluşturdukları bazı floresan kompleksleri yardımıyla yapılabilmektedir. Bazı amino asitler florometrik yoldan tayin edilebilir. Diğer taraftan bazı biyokimyasal bileşikler bir floresan madde ile tepkimeye sokulup yeni bir floresan ürün veya etiketlenmiş ürün oluşturularak tayin edilebilmektedir.

Luminometri, luminesans olarak adlandırılan; kimyasal reaksiyon sonucu açığa çıkmış görünür ışığın enerji düzeyine karşılık gelen emisyonunun ölçülmesidir. Kemilüminesans uyarılmış elektronların kararlı hale döndüğü sırada görülür. İlk uyarım floresan ürünün oluşması sonucu oluşur. Biyoluminesans aynı fenomeni tanımlar; fakat floresans ürünü oluşturan sadece enzimatik reaksiyondur. En sıklıkla kullanılan enzim lusiferazdır.

Polarimetri, transvers dalgaların polarize olmasının ölçülmesi ve yorumlanmasına yarayan yöntemdir.

Çoğunlukla elektromanyetik dalgaların ve ışığın incelenmesinde kullanılır. Anizotropik kristal katılar ve çözeltide kiral bir moleküle ait bilinen bir enantiyomerin baskın olarak bulunmas›, polarize düzlemde bulunan ışığı saptırır. Böyle maddeler optikçe aktif maddeler olarak adlandırılırlar. Polarizasyonun oryantasyonunun değişimi polarimetri olarak adlandırılırken, kullanılan cihaza polarimetre denilmektedir. Bu özellik anizotropik yapıların belirlenmesinde ya da şiral moleküllerin saflığının ortaya konmasında faydalıdır.

Alev fotometri atomik spektroskopinin bir dalıdır ve spektrometrede incelenen türler sadece atomlardır. Atomik spektroskopinin diğer iki dalı atomik absorbsiyon spektrofotometri ve indüklenmiş plazma atomik emisyon spektrometrisidir. Indüklenmiş plazma atomik emisyon spektrometresi pahalı bir analiz şekli olduğundan temel yöntem olarak yer almamaktadır. Tüm adı geçen yöntemlerde atomlar ışıkla uyarılır. Absorbsiyon yöntemleri, elektronlar üst düzeye geçerken ışığı soğurmaları esasına dayanırken, emisyon yöntemleri elektronların kararlı hale dönerken yaydıkları ışığın ölçülmesini esas alır.

Bilinmeyene ait emisyon şiddetinin standart çözeltiler ile karşılaştırılması veya dahili standart aracılığıyla ilgili metal kantitatif analizi yapılabilmektedir. Emisyonun şiddeti Scheibe-Lomakin denklemi ile açıklanabilir.

I = k .c n

c = elementin konsantrasyonu

k = orantı sabiti

n ~1 (kalibrasyon eğrisinin doğrusal kısmı)

Bu nedenle ışığın emisyonu örneğin konsantrasyonu ile doğrudan ilişkilidir.

Işığın serbest atomlar tarafından soğurulması atomik absorbsiyon spektrometrisinin (AAS) esasını oluşturur. atomik absorbsiyon spektrometrisi, alev fotometrinin aksine emisyona uğrayan ışığı değil soğurulan ışığı ölçer. Atomik absorbsiyon yönteminde atomlar kendilerine özgü dalga boyunda monokromatik kaynağı tarafından oluşturulan ışık ile uyarılır. Bu ışığı, sadece incelenen atomlar soğurabilir. Soğurulma sonucunda ışığın şiddeti azalacaktır. Bu düşüş incelenen atomların miktarı ile orantılıdır. Bu sayede oldukça duyarlı analizler yapılabilmektedir.

Elektroanalitik Yöntemler

Elektroanalitik yöntemler, bir elektrokimyasal hücrede bulunan analitin düzeyinin potansiyel (volt) ve/veya akım (amper) aracılığıyla ölçülmesi esasına dayanır. Bu metotlar farklı kategorilere ayrılır. Ana kategoriler;

• Potansiyometri
• Kolometri
• Voltametri

Potansiyometri, bir çözeltiye daldırılan iki elektrot arasındaki gerilim farkının ölçülmesi ilkesine dayanır. Elektrotlar ve elektrotların daldırıldığı çözelti bir elektrokimyasal hücre oluşturur. Elektrotlar arasındaki gerilim farkı bir pH/mV metre kullanılarak ölçülür. Elektrotlardan biri karşılaştırma elektrotu olup bu elektrotun yarı hücre gerilimi sabittir. Çalışma elektrotu olarak tanımlanan ikinci elektrotun yarı hücre gerilimi ise çözeltideki türlerin aktiflikleriyle değişir. Potansiyometride kullanılan elektrotlara iyon seçici elektrot (ISE) adı verilir. İyon seçici elektrotlar membran yapısında olup, diğer farklı iyonların varlığında seçici olarak ilgili iyonun ölçümünü sağlar. Bu kapsama spesifik iyonların ölçümünü yapan iyonlar ve çözeltide bulunan gazlar dahildir. En sık kullanılan ISE pH ölçüm probudur. Ölçümü yapılabilen diğer iyonlara flor, brom, kadmiyum ve çözeltide yer alan gazlara amonyak, karbon dioksit ve nitrojen örnek verilebilir.

İyon seçici elektrotlar galvanik hücre prensibine göre çalışır. Membran boyunca seçilen iyonların oluşturduğu potansiyel, referans elektrot ile karşılaştırılınca net yük belirlenmiş olur. Elde edilen yükün şiddeti konsantrasyon ile doğru orantılıdır. Galvanik hücre için temel formül şu şekildedir.

E hücre = E ise - E ref

İyon seçici elektrot tipleri farklı türde elektrotlar mevcut olup, seçim yapma özelliğini belirleyen membranı

yapısına göre sınıflandırılırlar. Bunlar;

• Polimer Membran Elektrotlar
• Katı Faz Elektrotları
• Gaz Ölçüm Elektrotları
• Cam Membran Elektrotlar

Voltametri, bir indikatör veya çalışma elektrotunun polarize olduğu şartlar altında, uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesinden faydalanarak analit hakkında bilgi sağlayan bir grup elektroanalitik yöntemdir. Voltametri terimi doğrusal tarama voltametri, siklik voltametri, atımlı voltametri ve stripping voltametri gibi türleri vardır.

Voltametri genel olarak redoks aktif bileşiklerin ölçümünde faydalı bir araç olarak karşımıza çıkmaktadır ve özellikle florofor ya da kromofor özellik göstermeyen analitler ölçümünde önemli katkıları vardır.

Kolometri, analitin bir yükseltgenme düzeyinden diğerine tamamen dönüştürülmesine dayanan analitik yöntemdir. Gravimetri veya titrasyon gibi mutlak bir yöntemdir ve kimyasal standartlar ile kalibrasyona ihtiyaç duyulmaz. Bu nedenle standartların mutlak miktarının belirlenmesinde çok önemli bir kaynaktır.

Kolometride ölçülen yükün aktarılması için sabit akım kaynağı kullanılır. 1 mol elektron 96485 kolomb yüküne eşdeğerdir. Bu 1 faraday değerine karşılık gelir.